一种用于检测中国南瓜曲叶病毒的RPA引物、探针、试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种用于检测中国南瓜曲叶病毒的RPA引物、探针、试剂盒及检测方法，属于生物安全技术领域。RPA引物基于中国南瓜曲叶病毒外壳蛋白基因序列设计的，RPA引物序列如SEQ ID No:1和2所示；PRA探针根据RPA引物扩增区域设计，其序列大小为49 bp，其5'端用FAM标记，3'端用C3

RPA primer, probe, kit and detection method for detecting Chinese pumpkin leaf curl virus

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测中国南瓜曲叶病毒的RPA引物、探针、试剂盒及检测方法


[0001]本专利技术属于生物安全
，具体地说，涉及一种用于检测中国南瓜曲叶病毒的RPA引物、探针、试剂盒及检测方法。

技术介绍

[0002]中国南瓜曲叶病毒（ Squash leaf curl China virus，SLCCNV ）是一类具有双联体孪生颗粒形态的植物病毒，属于双生病毒科（ Geminiviridae ）菜豆金色花叶病毒属（ Begomovirus ）。SLCCNV基因组结构包含DNA
‑
A和DNA
‑
B[1,2]。该病毒寄主范围较窄，主要为葫芦科作物，在自然条件下可以侵染南瓜、甜瓜、木、佛手瓜、哈密瓜、冬瓜等，近期有报道表明SLCCNV也可侵染水茄。该病毒由烟粉虱进行持久性传播，目前在东南亚地区包括越南、菲律宾、柬埔寨、泰国和东帝汶等以及中国地区包括安徽省云南省、广东省、海南省、广西省和台湾省等均有发生。该病毒能够造成瓜类作物皱缩卷曲，植株表现为矮化，且严重影响果实的产量和品质。
[0003]目前针对SLCCNV的检测方法主要包括RT
‑
PCR（检测AV1编码的CP ）、滚环复制（ rolling circle amplification ）、三抗夹心酶联免疫吸附试验（ TAS
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ELISA ）、斑点杂交免疫结合试验（ DIBA ）、免疫吸附技术聚合酶链反应（ IC
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PCR ）等。RT
‑
PCR方法检测时耗时较长且设备昂贵，ELISA等血清学方法检测时灵敏度较低，抗体制备和PVDF膜等价格也较为昂贵，实验室设置复杂，技术人员也应经验丰富，并且无法进行田间现场检测。因此，建立一种快速有效的田间检测技术对于控制病毒的传播和预防病害的流行至关重要。
[0004]重组酶聚合酶扩增
‑
侧流层析试纸条（Recombinase Polymerase Amplification combined with lateral flow strips，RPA
‑
LFS ）是一种通过等温扩增核酸结合试纸条实现可视化病害检测的新方法。该方法提供极少量目标DNA即可进行高度特异性DNA扩增，在设计引物和探针时加入特定的标签，在37
‑
42℃的等温扩增后，将扩增产物通过滴定法滴在试纸条上，或者将试纸条直接插入稀释后的扩增产物中，2
‑
3 min 内即可呈现可视化检测结果。该检测方法方便快速、简捷灵敏、对仪器设备等方面要求低，并且适合田间可视化检测。目前，RPA技术已广泛应用于病毒、细菌、支原体和寄生虫的快速检测中，但尚未见其在中国南瓜曲叶病毒检测方面的报道。

技术实现思路

[0005]、要解决的问题针对中国南瓜曲叶病毒尚无有效RPA检测技术的问题，本专利技术提供一种用于检测中国南瓜曲叶病毒的RPA引物、探针、试剂盒及检测方法，为该病毒在寄主植物和媒介昆虫中的现场检测和早期诊断提供新方法。
[0006]、技术方案为解决上述问题，本专利技术采用如下的技术方案。
[0007]一种用于检测中国南瓜曲叶病毒的RPA引物和探针，所述的RPA引物基于中国南瓜曲叶病毒的外壳蛋白基因设计，所述的RPA引物的上游引物如SEQ ID No:1所示，所述的RPA引物的下游引物如SEQ ID No:2所示；所述的PRA探针根据所述的RPA引物扩增区域设计，所述的RPA探针的序列大小为49bp，其5
’
端用FAM标记，3
’
端用C3
‑
Spacer修饰，且在RPA中间距5
’
端的33bp处进行THF修饰。
[0008]优选地，所述的RPA引物的下游引物包括如SEQ ID No:2所示的序列，且其5
’
端用 Biotin修饰；所述的RPA探针包括如SEQ ID No:3所示的序列，其5
’
端用FAM标记，3
’
端用C3
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Spacer修饰，且在RPA探针的序列中间距5
’
端的33bp处进行THF修饰。
[0009]一种含有上述所述的RPA引物和RPA探针的用于检测主植物和媒介昆虫中的中国南瓜曲叶病毒的试剂盒。
[0010]优选地，所述的试剂盒还包括RPA反应管、阳性对照模板、阴性对照模板中的至少一种。
[0011]一种用于检测中国南瓜曲叶病毒的检测方法，包括以下步骤:（1）提取样品中的DNA；（2）以步骤（1）提取的DNA作为待检测DNA模板，采用上述所述的RPA引物和RPA探针，在RPA反应管中进行RPA扩增反应；（3）分析RPA扩增产物。
[0012]优选地，步骤（1）中所述的样品为病的外壳蛋白基因全长的构造的质粒，所述的RPA引物和RPA探针的检出限为10
2 copies/μL。
[0013]优选地，步骤（2）中RPA扩增反应的反应体系以50μL计为如下所示：优选地，步骤（3）中分析RPA扩增产物的方法包括如下步骤:取RPA扩增产物与缓冲液混匀制备混合液，将试纸条上样区置于混合液中，4min
‑
5min后观察并记录结果；结果的判定如下:若试纸条的检测线位置出现条带（即为检测线），而且质控线位置出现条带（即为质控线），则表明该样品中含有中国南瓜曲叶病毒，若试纸条仅质控线位置出现条带（即为质控带），则表明该样品中不含有中国南瓜曲叶病毒。
[0014]、有益效果相比于现有技术，本专利技术的有益效果为：
本专利技术RPA引物、探针、试剂盒及检测方法，首次将RPA技术应用到中国南瓜曲叶病毒的分子检测，其兼具特异性强、灵敏度高、实用性好、对仪器设备要求较低的特点；其中RPA引物和探针基于中国南瓜曲叶病毒外壳蛋白基因序列设计，可稳定扩增且特异性较高，对中国南瓜曲叶病毒的检测准确率高；其中试剂盒和检测方法具有较高的检测灵敏度，可在38
°
C下和20min内完成对中国南瓜曲叶病毒的恒温扩增和可视化检测，无需PCR仪、凝胶电泳和成像系统，极大提高检测效率，解决了现有常规检测手段所需时间较长、对仪器设备条件和实验人员素质要求高的现象。由此可见，建立的用于检测中国南瓜曲叶病毒的RPA检测方法操作简单且结果易判定，为中国南瓜曲叶病毒在寄主植物和媒介昆虫上的的早期诊断、监测和指导科学施药提供有力技术支持。
附图说明
[0015]图1为实施例2中国南瓜曲叶病毒RPA检测方法的建立的检测结果图；图2为实施例3中国南瓜曲叶病毒RPA引物和探针的特异性检测结果图；图3为实施例4中国南瓜曲叶病毒RPA引物和探针的灵敏度检测结果图；图4为实施例5皖北南瓜生产区南瓜的中国南瓜曲叶病毒发病情况的检测结果图。
[0016]图5为实施例5皖北南瓜生产区烟粉虱的中国南瓜曲叶病毒发病情况的检测结果图。
具体实施方式
[0017]下面结合具体实施例对本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测中国南瓜曲叶病毒的RPA引物和RPA探针，其特征在于：所述的RPA引物基于中国南瓜曲叶病毒外壳蛋白基因序列设计，所述的RPA引物的上游引物如SEQ ID No:1所示，所述的RPA引物的下游引物如SEQ ID No:2所示； 所述的PRA探针根据所述的RPA引物扩增区域设计， 所述的RPA探针的序列大小为49 bp，其5
’
端用FAM标记，3
’
端用C3
‑
Spacer修饰，且在RPA探针的序列中间距5
’
端的33bp处进行THF修饰。2.根据权利要求1所述的用于检测中国南瓜曲叶病毒的RPA引物和RPA探针，其特征在于：所述的RPA引物的下游引物包括如SEQ ID No:2所示的序列，且其5
’
端用Biotin修饰； 所述的RPA探针包括如SEQ ID No:3所示的序列，其5
’
端用FAM标记，3
’
端用C3
‑
Spacer修饰，且在RPA探针的序列中间距5
’
端的33bp处进行THF修饰。3.一种含有权利要求1或2所述的RPA引物和RPA探针的用于检测中国南瓜曲叶病毒的试剂盒。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还包括RPA反应管、阴性对照模板、阳性对照模板中的至少一种。5.一种用于检测中国南瓜曲叶病毒的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）提取样品中的DNA；（2）以步骤（1）提取的DNA作为待检测DNA模板，采用权利要求1或2所述的RPA引物和RPA探针，在RPA反应管中进行RPA扩增反应；（3）分析RPA扩增产物。6.根据权利要求5所述的用于检测中国南瓜曲叶病毒的检测方法，其特征在于：所述的RPA引物和RPA探针的检出限为10
2 copies/μL。7.根据权利要求5所述的用于检测中国南瓜曲叶病...

【专利技术属性】
技术研发人员：严丹侃，陈莹，王芳，马超，韩科雷，胡淑珍，李婷，
申请(专利权)人：安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所，
类型：发明
国别省市：