代谢甘油生产人参皂苷CK的重组酿酒酵母菌及构建方法技术

本发明专利技术公开了代谢甘油生产人参皂苷CK的重组酿酒酵母菌及构建方法，构建方法为：(1)向能合成原人参二醇的酿酒酵母中导入糖基转移酶UGT1基因表达盒、葡萄糖磷酸变位酶的PGM2基因表达盒和UDP葡萄糖焦磷酸化酶UGP1基因表达盒，得到重组菌1；(2)向重组菌1中导入甘油运输蛋白CjFPS1基因表达盒、甘油脱氢酶OpGDH基因表达盒和二羟基丙酮激酶DAK1基因表达盒，得到重组菌2；(3)向重组菌2中导入3

Recombinant Saccharomyces cerevisiae metabolizing glycerol to produce ginsenoside CK and its construction method

【技术实现步骤摘要】
代谢甘油生产人参皂苷CK的重组酿酒酵母菌及构建方法


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及代谢甘油生产人参皂苷CK的重组酿酒酵母及构建方法与应用。

技术介绍

[0002]人参皂苷CK(简称为CK)属于原人参二醇型皂苷，具有抗癌、抗过敏、抗衰老、抗糖尿病等生物学特性。CK在人参中含量极低，据报道，其主要通过轻度酸水解碱处理，微生物转化和和酶促转化将主要人参皂苷Rb1、Rd、Rg2等人参皂苷水解获得，单成本仍然较高。近年来，合成生物学的研究不断发展，使微生物能够合成动植物源化合物。虽然有研究人员构建出了能生产人参皂苷CK的菌株，但产量仍然有待提高。
[0003]现有研究多以葡萄糖为底物生产人参皂苷，甘油与葡萄糖相比具有更高的还原度，且甘油是石油化工行业的主要产物，具有低成本的特点，因此利用甘油作为底物合成人参皂苷CK理论上更具有潜力。然而，目前未有通过改造甘油代谢生产萜类天然产物特别是三萜皂苷的研究。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种代谢甘油生产人参皂苷CK的重组酿酒酵母菌。
[0005]本专利技术的第二个目的是提供一种代谢甘油生产人参皂苷CK的重组酿酒酵母菌的构建方法。
[0006]本专利技术的第三个目的是提供一种代谢甘油生产人参皂苷CK的重组酿酒酵母菌发酵生产人参皂苷CK的应用。
[0007]本专利技术的第四个目的是提供另一种代谢甘油生产人参皂苷CK的重组酿酒酵母菌。
[0008]本专利技术的第五个目的是提供另一种代谢甘油生产人参皂苷CK的重组酿酒酵母菌的构建方法。
[0009]本专利技术的第六个目的是提供另一种代谢甘油生产人参皂苷CK的重组酿酒酵母菌发酵生产人参皂苷CK的应用。
[0010]本专利技术的技术方案概述如下：
[0011]代谢甘油生产人参皂苷CK的重组酿酒酵母菌的构建方法，包括如下步骤：
[0012](1)向能合成原人参二醇的酿酒酵母中导入糖基转移酶UGT1基因表达盒、葡萄糖磷酸变位酶的PGM2基因表达盒和UDP葡萄糖焦磷酸化酶UGP1基因表达盒，得到重组菌1；
[0013]所述糖基转移酶UGT1基因的核苷酸序列以SEQ ID NO.1所示；
[0014]所述葡萄糖磷酸变位酶PGM2基因的核苷酸序列以SEQ ID NO.2所示；
[0015]所述UDP葡萄糖焦磷酸化酶UGP1基因的核苷酸序列以SEQ ID NO.3所示；
[0016](2)向重组菌1中导入甘油运输蛋白CjFPS1基因表达盒、甘油脱氢酶OpGDH基因表达盒和二羟基丙酮激酶DAK1基因表达盒，得到重组菌2；
[0017]所述甘油运输蛋白CjFPS1基因的核苷酸序列以SEQ ID NO.4所示；
[0018]所述甘油脱氢酶OpGDH基因的核苷酸序列以SEQ ID NO.5所示；
[0019]所述二羟基丙酮激酶DAK1基因的核苷酸序列以SEQ ID NO.6所示。
[0020]上述方法构建的代谢甘油生产人参皂苷CK的重组酿酒酵母菌。
[0021]上述代谢甘油生产人参皂苷CK的重组酿酒酵母菌生产人参皂苷CK的应用。
[0022]另一种代谢甘油生产人参皂苷CK的重组酿酒酵母菌的构建方法，包括如下步骤：
[0023](1)向能合成原人参二醇的酿酒酵母中导入糖基转移酶UGT1基因表达盒、葡萄糖磷酸变位酶的PGM2基因表达盒和UDP葡萄糖焦磷酸化酶UGP1基因表达盒，得到重组菌1；
[0024]所述糖基转移酶UGT1基因的核苷酸序列以SEQ ID NO.1所示；
[0025]所述葡萄糖磷酸变位酶PGM2基因的核苷酸序列以SEQ ID NO.2所示；
[0026]所述UDP葡萄糖焦磷酸化酶UGP1基因的核苷酸序列以SEQ ID NO.3所示；
[0027](2)向重组菌1中导入甘油运输蛋白CjFPS1基因表达盒、甘油脱氢酶OpGDH基因表达盒和二羟基丙酮激酶DAK1基因表达盒，得到重组菌2；
[0028]所述甘油运输蛋白CjFPS1基因的核苷酸序列以SEQ ID NO.4所示；
[0029]所述甘油脱氢酶OpGDH基因的核苷酸序列以SEQ ID NO.5所示；
[0030]所述二羟基丙酮激酶DAK1基因的核苷酸序列以SEQ ID NO.6所示。
[0031](3)向重组菌2中导入3
‑
羟基
‑3‑
甲基戊二酰辅酶A还原酶HMGr基因表达盒，得到重组菌3；
[0032]所述3
‑
羟基
‑3‑
甲基戊二酰辅酶A还原酶HMGr基因的核苷酸序列以SEQ ID NO.7所示。
[0033]上述方法构建的代谢甘油生产人参皂苷CK的重组酿酒酵母菌。
[0034]上述代谢甘油生产人参皂苷CK的重组酿酒酵母菌生产人参皂苷CK的应用。
[0035]本专利技术的优点：
[0036]本专利技术成功构建了代谢甘油生产人参皂苷CK的重组酿酒酵母菌。实验证明，本专利技术的代谢甘油生产人参皂苷CK的重组酿酒酵母菌发酵得到人参皂苷CK，重组菌1、2、3的人参皂苷CK产量依次为109.84mg/L，152.12mg/L与330.94mg/L。
附图说明
[0037]图1.代谢甘油合成人参皂苷CK的重组酿酒酵母发酵合成人参皂苷CK的产量。其中重组菌1用YPD液体培养基，重组菌2、重组菌3用YPG液体培养基发酵。
具体实施方式
[0038]下面通过具体实施例对本专利技术作进一步的说明。
[0039]用能合成原人参二醇的酿酒酵母做为本专利技术的出发菌株，本专利技术选用的出发菌株来自中国专利技术专利，专利号201410735927.X，专利技术名称为：一种能提高达玛烯二醇转化效率的融合蛋白质及构建方法及应用中实施例3获得的“合成原人参二醇的酵母菌株W3a”，在本专利技术中简称“酿酒酵母W3a”，但对本专利技术不进行限定。
[0040]其它包括达玛烯二醇合酶DS、原人参二醇合酶PPDS及细胞色素P450酶还原酶AtCPR1编码序列的重组菌也可以用于本专利技术。
[0041]下面实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0042]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0043]酿酒酵母ATCC208352，酿酒酵母ATCC4040002，购买的时间，2016.6，网址：https://www.atcc.org/)
[0044]实施例1重组酿酒酵母菌1(重组菌1)的构建方法
[0045]将糖基转移酶UGT1基因表达盒，葡萄糖磷酸变位酶的PGM2基因表达盒以及UDP葡萄糖焦磷酸化酶UGP1基因表达盒导入酿酒酵母W3a，得重组菌1。
[0046]所述糖基转移酶UGT1来源于人参(Ginseng)，由武汉金开瑞生物工程有限公司酿酒酵母密码子优化后，得到糖基转移酶UGT1基因的核酸序列用S本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.代谢甘油生产人参皂苷CK的重组酿酒酵母菌的构建方法，其特征是包括如下步骤：(1)向能合成原人参二醇的酿酒酵母中导入糖基转移酶UGT1基因表达盒、葡萄糖磷酸变位酶的PGM2基因表达盒和UDP葡萄糖焦磷酸化酶UGP1基因表达盒，得到重组菌1；所述糖基转移酶UGT1基因的核苷酸序列以SEQ ID NO.1所示；所述葡萄糖磷酸变位酶PGM2基因的核苷酸序列以SEQ ID NO.2所示；所述UDP葡萄糖焦磷酸化酶UGP1基因的核苷酸序列以SEQ ID NO.3所示；(2)向重组菌1中导入甘油运输蛋白CjFPS1基因表达盒、甘油脱氢酶OpGDH基因表达盒和二羟基丙酮激酶DAK1基因表达盒，得到重组菌2；所述甘油运输蛋白CjFPS1基因的核苷酸序列以SEQ ID NO.4所示；所述甘油脱氢酶OpGDH基因的核苷酸序列以SEQ ID NO.5所示；所述二羟基丙酮激酶DAK1基因的核苷酸序列以SEQ ID NO.6所示。2.代谢甘油生产人参皂苷CK的重组酿酒酵母菌的构建方法，其特征是包括如下步骤：(1)向能合成原人参二醇的酿酒酵母中导入糖基转移酶UGT1基因表达盒、葡萄糖磷酸变位酶的PGM2基因表达盒和UDP葡萄糖焦磷酸化酶UGP1基因表达盒，得到...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢文玉，张传波，田锦平，刘瑞霞，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：