一种大豆症青相关病毒侵染性克隆载体与大豆高效接种方法技术

本发明专利技术公开了一种大豆症青相关病毒侵染性克隆载体和大豆高效接种方法，将不少于1.2个串联重复的大豆症青相关病毒全基因组序列构建到pBINPLUS载体上制备得到大豆症青相关病毒(SoSGV)侵染性克隆载体，并且能够通过发根农杆菌K599诱导的毛状根成功侵染大豆，提供一种解决大豆双生病毒(大豆症青相关病毒)侵染性克隆不易侵染大豆问题的方法。本发明专利技术仅用3条引物即可构建2.0个串联重复的侵染性克隆载体；优化大豆中的病毒接种方法：PCR和Western Blot检测结果表明经K599诱导的大豆症青相关病毒能够在多个大豆品种中实现系统侵染，产生症青症状，能作为后续筛选抗性品种体系。体系。体系。

An infectious cloning vector of soybean disease associated virus and an efficient inoculation method for soybean

【技术实现步骤摘要】
一种大豆症青相关病毒侵染性克隆载体与大豆高效接种方法


[0001]本专利技术涉及植物病毒学和基因工程领域，特别涉及一种大豆症青相关病毒(SoSGV)侵染性克隆载体和大豆高效接种方法。

技术介绍

[0002]大豆“症青”是指大豆正常成熟时，植株或部分分枝仍然叶绿、枝青，有荚但豆荚空瘪或者籽粒瘪烂现象。通过Small RNA测序结合生物信息学分析，技术人员在黄淮海大豆主产区多个地方的症青大豆病株中鉴定到一种新型重组双生病毒，暂命名为大豆症青相关病毒(Soybean stay
‑
green associated virus,SoSGV)(Cheng,R.et al.A new distinct geminivirus causes soybean stay
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green disease.Molecular Plant(2022)doi:10/gptbfj)。
[0003]双生病毒科病毒是世界范围内分布广泛的一类植物DNA病毒，为仅次于马铃薯Y病毒科的第2大植物病毒科，在世界范围内对重要作物造成严重损失。目前尚无防治大豆双生病毒的有效药剂，筛选和培育抗病品种是控制大豆症青危害的最有效手段。对大豆双生病毒的抗病性进行鉴定必须要在不同品种的大豆上进行病毒接种，从而评价病毒病症状的发生与危害程度。大多数双生病毒的增殖部位局限于植物韧皮部组织，因此常规的机械摩擦接毒不适用于双生病毒的接种。
[0004]双生病毒能够通过其介体昆虫进行传播。昆虫介体接种法则需要先专门饲养大量的无毒的昆虫作为传毒介体，再让传毒介体获取病毒，最后由获毒的介体进行传毒。介体昆虫接种的操作环节多，培养昆虫的时间长，需要的昆虫数量多，接种需要的人工和时间成本高。接种过程中很难保证每株植物上的昆虫数量，容易发生漏接，不利于抗病性鉴定。
[0005]双生病毒的侵染性克隆通常需要接种于寄主植物的韧皮部以形成系统侵染。根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)可以介导双生病毒侵染性克隆在本氏烟中的侵染。通常只需将带有侵染性克隆的根癌农杆菌菌液注入茎部或叶柄即可完成系统侵染。然而，基于根癌农杆菌的茎部注射并不能成功引起大豆双生病毒的侵染，且效率非常低。发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)同属于根瘤菌科(Rhizobiacease)，是一种侵染寄主范围很广的农杆菌，可以很好的侵染大豆。以往的研究表明发根农杆菌侵染会诱导植物产生大量毛状根，从而促进扦插的植物生根，提高存活率。另外，还可以通过发根农杆菌向植物基因组中插入外源基因，能够在诱导产生的毛状根中大量表达外源基因产物。发根农杆菌介导大豆双生病毒侵染性克隆的接种体系尚未有报道。
[0006]近几年，大豆症青相关病毒(SoSGV)在黄淮海大豆产区大面积发生，导致大豆普遍减产，重发区产量仅30公斤/亩，甚至绝收，造成严重的经济损失。因此，亟需开发一种便捷高效的大豆症青相关病毒的侵染性克隆及接种技术，为将来筛选和培育大豆症青相关病毒抗性品种提供材料。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供大豆症青相关病毒侵染性克隆载体及转基因重组菌及其应用。
[0008]本专利技术的另一目的在于提供一种大豆症青相关病毒接种大豆的方法。
[0009]本专利技术构建了大豆症青相关病毒的侵染性克隆，并且能够通过发根农杆菌K599诱导的毛状根成功侵染大豆，提供一种解决大豆双生病毒(大豆症青相关病毒)侵染性克隆不易侵染大豆问题的方法。
[0010]为实现上述目的，本专利技术包括以下步骤：
[0011]一种大豆症青相关病毒侵染性克隆载体，该侵染性克隆载体是将不少于1.2个串联重复的大豆症青相关病毒全基因组序列构建到pBINPLUS载体上制备得到的，所述大豆症青相关病毒的全基因组序列如SEQ ID NO.1所示。
[0012]优选的，所述的侵染性克隆载体是将2.0个串联重复的大豆症青相关病毒(SoSGV)全基因组序列构建到pBINPLUS载体上制备得到的。
[0013]作为一种优选技术方案，上述的侵染性克隆载体采用以下步骤制备：
[0014](1)使用引物P1和引物P2扩增基因组的第一个全长基因组拷贝，约2.7kb，通过无缝连接重组到SalⅠ和BamHⅠ酶切后的pBINPLUS载体，经克隆后提取质粒pBINPLUS
‑
1.0
×
SoSGV；
[0015](2)使用引物P2和引物P3扩增基因组的第二个全长基因组拷贝，约2.7kb，通过无缝连接重组到BamHⅠ酶切后的pBINPLUS
‑
1.0
×
SoSGV质粒；使用引物P4和引物P5筛选阳性克隆；挑选阳性克隆培养，提取质粒pBINPLUS
‑
2.0
×
SoSGV；经引物P4和引物P5测序验证得到大豆症青相关病毒侵染性克隆载体。
[0016]一种大豆症青相关病毒侵染性转基因重组菌，将上述的大豆症青相关病毒侵染性克隆载体电击导入发根农杆菌K599构建得到，K599中携带SoSGV侵染性克隆。
[0017]一种大豆症青相关病毒接种大豆的方法，将上述的大豆症青相关病毒侵染性克隆载体电击导入发根农杆菌K599，以发根农杆菌K599介导接种大豆症青相关病毒。
[0018]作为一种优选技术方案：采用农杆菌处理液调整发根农杆菌的OD600值制备发根农杆菌菌液，将萌发7天大豆幼苗的下胚轴切除，斜切面涂有菌体，置入无菌蛭石中；每株植物使用5mL处理后的发根农杆菌菌液浇灌；密闭保湿2至3周。以病毒编码外壳蛋白的基因设计引物P6和P7，PCR检测诱导生根的大豆植株系统叶中病毒侵染情况。
[0019]所述的农杆菌处理液的配方为：在无菌水中，按以下浓度配制处理液，
[0020][2
‑
(4
‑
morpholino)ethanesulfonic acid]：0.5g/L
[0021]Sucrose：20g/L
[0022]B5：3.21g/L
[0023]Acetosyringone：100μM。
[0024]进一步优选的，使用农杆菌处理液调整发根农杆菌OD600为1.0。
[0025]表1为本专利技术技术方案所用的引物序列
[0026]P1CAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGCTGTTAAGCGCCTTGGCGTAAGCP2CGAGCTCGGTACCCGGGGATCCGGCAGTAAGTCAGAGGCTCTTAAP3ATTAAGAGCCTCTGACTTACTGCCGCTGTTAAGCGCCTTGGCGTAAGC
P4GGATTGCAGAGGAAGATAGTP5AATCCAGCTCCGACGTCAAGTP6ATGGATTACAGCAGGAAGAGGP7TTACAATTTGCTCTTGAAATACGT
[0027]上述的大豆症青相关病本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种大豆症青相关病毒侵染性克隆载体，其特征在于，该侵染性克隆载体是将不少于1.2个串联重复的大豆症青相关病毒全基因组序列构建到pBINPLUS载体上制备得到的，所述大豆症青相关病毒的全基因组序列如SEQ ID NO.1所示。2.根据权利要求1所述的大豆症青相关病毒侵染性克隆载体，其特征在于，所述的侵染性克隆载体是将2个串联重复的大豆症青相关病毒全基因组序列构建到pBINPLUS载体上制备得到的。3.根据权利要求2所述的大豆症青相关病毒侵染性克隆载体，其特征在于，所述的侵染性克隆载体采用以下步骤制备：(1)使用引物P1和引物P2扩增基因组的第一个全长基因组拷贝，通过无缝连接重组到SalⅠ和BamHⅠ酶切后的pBINPLUS载体，经克隆后提取质粒pBINPLUS
‑
1.0
×
SoSGV；P1：CAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGCTGTTAAGCGCCTTGGCGTAAGC；P2：CGAGCTCGGTACCCGGGGATCCGGCAGTAAGTCAGAGGCTCTTAA；(2)使用引物P2和引物P3扩增基因组的第二个全长基因组拷贝，通过无缝连接重组到BamHⅠ酶切后的pBINPLUS
‑
1.0
×
SoSGV质粒；使用引物P4和引物P5筛选阳性克隆；挑选阳性克隆培养，提取质粒pBINPLUS
‑
2.0
×
SoSGV；经引物P4和引物P5测序验证得到大豆症青相关病毒侵染性克隆载体；P3：ATTAAGAGCCTCTGACTTACTGCCGCTGTTAAGCGCCTTGGCGTAAGC；P4：GGATTGCAGAGGAAGATAGT；P5：AATCCAGCTCCGACGTCAAG...

【专利技术属性】
技术研发人员：陶小荣，徐毅，程锐祥，梅若鑫，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：