一种基于RGO-CMCS-Hemin/PdNPs电化学传感器检测GPC3的方法技术

一种基于RGO

A method of GPC3 detection based on RGO CMCs hemin / pdnps electrochemical sensor

【技术实现步骤摘要】
一种基于RGO
‑
CMCS
‑
Hemin/Pd NPs电化学传感器检测GPC3的方法


[0001]本专利技术属于生物检测领域，具体涉及一种基于适配体修饰石墨烯纳米复合材料检测GPC3的方法。

技术介绍

[0002]磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（glypican
‑
3 , GPC3）是一种细胞膜表面的硫酸乙酰肝素（HS）糖蛋白。目前常用的GPC3检测技术有酶联免疫分析法（EL1SA），化学发光免疫分析法（CLIA），放射免疫法（RIA），生物免疫传感器等。公开号为CN 107085109A的专利技术专利，涉及一种高正电荷绿色荧光蛋白（ScGFP）在制备肝癌早期诊断GPC3试剂盒中的应用，其利用抗体与GPC3蛋白的专一性识别和ScGFP与侧链的电荷结合作用，实现对GPC3的检测。公开号为 CN 109580951A的专利技术专利，涉及一种联合多抗体检测早期肝癌标志物的试剂盒及其使用方法，其利用带有颜色的包被抗体的荧光微球来捕获标志物，从而诊断早期肝癌。这2项专利所涉及的抗体本身还存在不足，如成本高、易降解、批间差异大、不易存储和运输等。因此，迫切需要开发一种新型的、方便、灵敏的GPC3检测方法。

技术实现思路

[0003]本专利技术所要解决的技术问题是提供一种基于还原氧化石墨烯
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羧甲基壳聚糖
‑
氯化血红素/纳米钯（RGO
‑
CMCS
‑
Hemin/Pd NPs）的纳米复合材料，构建电化学适配体传感器，实现GPC3的检测，该方法最低检测限是9.898 ng/mL。
[0004]本专利技术的检测原理为：利用RGO大的比表面积、羧甲基壳聚糖（CMCS）良好的生物相容性、Pd NPs的高电导率以及电活性物质Hemin，合成了RGO
‑
CMCS
‑
Hemin/Pd NPs纳米复合材料。RGO
‑
CMCS
‑
Hemin/Pd NPs纳米复合材料中的Pd NPs与巯基化GPC3适配体（GPC3
Apt
）形成配位键，使得GPC3
Apt
牢固固定在电极表面；当GPC3存在时，单链的GPC3
Apt
与GPC3特异性结合形成具有稳定的空间结构的适配体
‑
蛋白复合物，阻碍着RGO
‑
CMCS
‑
Hemin/Pd NPs中Hemin（Fe
2+
）/ Hemin（Fe
3+
）之间的氧化还原反应，导致电流信号降低，采用电化学工作站中的微分脉冲伏安法（DPV）技术记录着电流信号的变化，从而实现GPC3的浓度测定。一方面，RGO
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CMCS
‑
Hemin/Pd NPs纳米复合材料可以放大电化学适配体传感器的检测信号，提高传感器的灵敏度；另一方面，该材料可以作为原位电活性探针，指示着电化学适配体传感器的电流信号，实现无标记的GPC3检测。
[0005]本专利技术按照以下步骤进行：步骤1： RGO
‑
CMCS
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Hemin/Pd NPs纳米复合材料的制备（1）还原性氧化石墨烯（RGO）的制备：往水中倒入氧化石墨烯（GO），超声破碎后得到GO悬浮液液，再加入抗坏血酸（AA）还原，得RGO悬浮液。
[0006]（2）还原性氧化石墨烯
‑
氯化血红素（RGO
‑
Hemin）的制备：用氨水溶解Hemin后加入到RGO溶液，混合后超声破碎，得到RGO
‑ꢀ
Hemin分散液。
[0007]（3）还原性氧化石墨烯
‑
羧甲基壳聚糖
‑
氯化血红素（RGO
‑
CMCS
‑
Hemin）的制备：将羧甲基壳聚糖（CMCS）用乙酸溶解后，将CMCS溶液加入到RGO
‑ꢀ
Hemin分散液，混匀超声破碎得到RGO
‑
CMCS
‑
Hemin溶液。
[0008]（4）还原氧化石墨烯
‑
羧甲基壳聚糖
‑
氯化血红素/纳米钯（RGO
‑
CMCS
‑
Hemin /Pd）复合材料的制备：将六氯钯酸钠溶液和AA加入到RGO
‑
CMCS
‑
Hemin溶液中，搅拌，离心去上清液，得到RGO
‑
CMCS
‑
Hemin/Pd NPs溶液。
[0009]步骤2：电极的修饰与传感界面的构建（1）Au NPs/SPE的制备：将丝网印刷电极（SPE）置于稀H2SO4溶液中活化；将活化后的SPE置入含有氯金酸（HAuCl4）溶液中，利用i
‑
t进行恒电位沉积，得Au NPs/SPE电极。
[0010]（2）RGO
‑
CMCS
‑
Hemin/Pd NPs/Au NPs/SPE传感界面的制备：滴加RGO
‑ꢀ
CMCS
‑
Hemin/Pd NPs悬浊液在Au NPs/SPE上，孵育，用1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐/N
‑
羟基琥珀酰亚胺（EDC/NHS）的活化剂浸泡，自然晾干，得到RGO
‑
CMCS
‑
Hemin/Pd NPs/Au NPs/SPE。
[0011]（3）GPC3
Apt
/RGO
‑
CMCS
‑
Hemin/Pd NPs/Au NPs/SPE电化学适配体传感器的构建：将GPC3
Apt
滴加在构建好的RGO
‑
CMCS
‑
Hemin/Pd NPs/Au NPs/SPE传感界面孵育，用水洗涤并晾干，再用牛血清蛋白（BSA）溶液封闭，得到GPC3
Apt
/RGO
‑
CMCS
‑
Hemin/Pd NPs/Au NPs /SPE工作电极。
[0012]步骤3：GPC3工作曲线的绘制（1）将步骤2的工作电极置于PBS缓冲溶液中，采用电化学工作站的DPV进行扫描，记录传感器的响应电流值。
[0013]（2）检测不同浓度的GPC3，记录电流峰值，根据该浓度下的响应电流峰值和GPC3空白组响应电流峰值的差值与GPC3浓度的关系，绘制GPC3工作曲线。
[0014]步骤4：实际血清样本中GPC3的检测（1）将待测样品与GPC3混合加入到步骤2的工作电极上，孵育一段时间后将电极浸入PBS缓冲溶液中，采用DPV检测技术进行扫描，同时设置空白组，记录电流响应峰值。
[0015]（2）根据步骤3所本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种非诊断目的基于还原氧化石墨烯
‑
羧甲基壳聚糖
‑
氯化血红素/纳米钯RGO
‑
CMCS
‑ꢀ
Hemin/Pd NPs复合材料的电化学适配体传感器检测GPC3的方法，按以下步骤进行：步骤1：RGO
‑
CMCS
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Hemin/Pd NPs复合材料的制备（1）还原性氧化石墨烯RGO的制备：将30.0 mg 氧化石墨烯GO分散于30.0 mL蒸馏水中，超声破碎2 h，加入90.0 mg 抗坏血酸AA还原，得1.0 mg/mL的RGO悬浮液；（2）还原性氧化石墨烯
‑
氯化血红素RGO
‑
Hemin的制备：称取10.0 mg的氯化血红素Hemin，加入20.0
ꢀµ
L氨水，再加入10.0 mL蒸馏水，得到1.0 mg/mL的Hemin溶液；取10.0 mL 1.0 mg/mL的RGO悬浮液，加入10.0 mL Hemin溶液，混匀后超声破碎，获得1.0 mg/mL 的RGO
‑
Hemin悬浮液；（3）还原性氧化石墨烯
‑
羧甲基壳聚糖
‑
氯化血红素RGO
‑
CMCS
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Hemin的制备：称取50.0 mg的羧甲基壳聚糖CMCS加入到1.0%的乙酸溶液中，搅拌均匀得到1.0 mg/mL的CMCS溶液，取10.0 mL CMCS溶液加入到RGO
‑
Hemin溶液中，超声破碎，得到1.0 mg/mL 的RGO
‑
CMCS
‑
Hemin溶液；（4）还原氧化石墨烯
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羧甲基壳聚糖
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氯化血红素/纳米钯RGO
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CMCS
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Hemin /Pd NPs复合材料的制备：将2.0mL浓度为 20.0mmol/L的六氯钯酸钠溶液和10.0 mg AA加入到10.0 mL的RGO
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CMCS
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Hemin溶液中；搅拌16 h后取出；转速8000 r/min离心15 min；离心完成后，用移液枪去掉上清液，刮取黑色沉淀，用超纯水洗涤并溶解，得到1.0 mg/mL 的RGO
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CMCS
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Hemin/Pd NPs溶液；步骤2：电极的修饰与生物传感界面的构建（1）将丝网印刷电极SPE浸入浓度为0.5 mo...

【专利技术属性】
技术研发人员：李桂银，李胜男，曹礼萍，李鑫镐，周治德，梁晋涛，
申请(专利权)人：桂林电子科技大学，
类型：发明
国别省市：