一种DNA编码化合物库的RNA靶标筛选方法技术

本发明专利技术提供了一种针对RNA靶标进行DNA编码化合物库筛选的方法。本发明专利技术的方法通过在DNA编码化合物库中加入RNA靶标对应的封闭片段，封闭可能与RNA靶标结合的DNA序列，从而降低DNA编码化合物库筛选的假阳性率。低DNA编码化合物库筛选的假阳性率。

【技术实现步骤摘要】
一种DNA编码化合物库的RNA靶标筛选方法


[0001]本专利技术属于药物筛选领域，具体涉及一种DNA编码化合物库基于RNA靶标的筛选方法。

技术介绍

[0002]在新药研发领域，针对生物靶标的高通量筛选是快速获得先导化合物的主要手段之一。然而，基于单个分子的传统高通量筛选所需时间长、设备投入巨大、库化合物数量有限(数百万)，且化合物库的建成需要数十年的积累，限制了先导化合物的发现效率与可能性。近年来出现的DNA编码化合物库技术(WO2005058479、WO2018166532、CN103882532)，结合了组合化学和分子生物学技术，在分子水平上将每个化合物加上一个DNA标签，能在极短的时间内合成高达亿级的化合物库，而且化合物能够通过基因测序的方法进行识别，大幅度地增加了化合物库的大小和合成效率，成为下一代化合物库筛选技术的趋势。DNA编码化合物库技术正开始在制药行业广泛应用，并产生了诸多积极的效果(Accounts of Chemical Research,2014,47,1247
‑
1255)。
[0003]然而，由于DNA编码化合物都带有DNA标签，而RNA靶标可能与DNA标签产生相互作用，从而导致筛选数据中产生假阳性信号，干扰真实信号的提取和解读。目前有未在文献中公开报道的方法帮助识别此类信号。具体做法是通过构建带有相同DNA标签、但不含小分子的DNA库作为对照，同时筛选后进行数据分析的方法。但是这种方法需要重新建库，时间较长，成本较高，并且构建出的DNA库与原库的DNA标签很难做到完全一致，从而限制了这种方法的应用。因此，开发一种针对RNA靶标能够快速、经济地筛选方法，能够进一步提升DNA编码化合物库筛选技术的应用价值。

技术实现思路

[0004]本专利技术提供了一种DNA编码化合物库的RNA靶标筛选方法，其特征在于：筛选前在DNA编码化合物库中加入RNA靶标对应的封闭片段，然后进行筛选。
[0005]进一步地，所述封闭片段选自RNA片段、DNA片段和/或两者组合。
[0006]优选地，所述RNA靶标对应的封闭片段的设计为：从RNA靶标序列的5
’
端开始截取5～20nt长度的序列为封闭片段序列1，随后以1～10nt长度的位移从5
’
端再截取5～20nt长度的序列为封闭片段序列2，直至全部截取，得到n种封闭片段序列1～n；优选地，截取长度为8～15nt，位移长度为2～6nt；更优选地，截取长度为12nt，位移长度为3nt。
[0007]更优选地，封闭片段序列1的截取需要覆盖RNA靶标中的第一个不配对的环形区域并超出3bp。
[0008]进一步地，所述封闭片段的设计只覆盖RNA靶标的不配对的环形区域。
[0009]进一步地，所述封闭片段的设计覆盖RNA靶标的全部区域。
[0010]进一步地，所述封闭片段的设计覆盖RNA靶标的60％以上的区域；优选地，覆盖70％以上的区域；更优选地，覆盖80％以上的区域。
[0011]优选地，筛选前在DNA编码化合物库中加入RNA靶标对应的封闭片段的步骤为：向DNA编码化合物库中加入封闭片段序列1，混合均匀后静置，再加入封闭片段序列2，混合均匀后静置，直至加入封闭片段序列n，混合均匀后静置。
[0012]优选地，所述筛选方法步骤包括：
[0013]a)筛选前在DNA编码化合物库中加入RNA靶标对应的封闭片段；
[0014]b)将RNA靶标和已封闭的DNA编码化合物库进行孵育；
[0015]c)固定RNA靶标，并进行洗脱；
[0016]d)解离得到筛选出的DNA编码化合物。
[0017]优选地，所述筛选方法步骤包括：
[0018]a)筛选前在DNA编码化合物库中加入RNA靶标对应的封闭片段；
[0019]b)固定RNA靶标，将RNA靶标和已封闭的DNA编码化合物库进行孵育；
[0020]c)洗脱；
[0021]d)解离得到筛选出的DNA编码化合物。
[0022]更优选地，所述封闭片段和RNA靶标的用量比值为1：0.8～1.2。
[0023]更优选地，所述步骤b中的孵育是在筛选缓冲液中进行，筛选缓冲液为50mM 2
‑
,氨基丁三醇，80mM氯化钾，0.3mg/mL鲑鱼精DNA,0.01％吐温20,pH 7.5；或者筛选缓冲液为50mM 2
‑
,氨基丁三醇,100mM氯化钾,2mM氯化镁,0.3mg/mL鲑鱼精DNA,0.05％吐温20,pH 7.4。
[0024]更优选地，所述步骤b或步骤c中通过磁珠将RNA靶标进行固定。
[0025]更优选地，所述步骤c中通过洗脱缓冲液进行洗脱，洗脱缓冲液为50mM 2
‑
,氨基丁三醇，80mM氯化钾，0.3mg/mL鲑鱼精DNA,400uM生物素,0.01％吐温20,pH 7.5；或者洗脱缓冲液为50mM 2
‑
,氨基丁三醇,100mM氯化钾,2mM氯化镁,0.3mg/mL鲑鱼精DNA,0.05％吐温20,pH 7.4。
[0026]更优选地，所述步骤d中解离是通过加入热解离缓冲液，在95℃孵育10分钟进行，所述热解离缓冲液为50mM 2
‑
,氨基丁三醇，160mM氯化钾，pH 7.5。
[0027]更优选地，所述步骤d中解离是通过加入含有具有结合RNA靶标作用的阳性化合物的解离缓冲液进行。进一步优选地，加入含有具有结合RNA靶标作用的阳性化合物的解离缓冲液后室温孵育15分钟。进一步地，所述解离缓冲液为50mM 2
‑
,氨基丁三醇,100mM氯化钾，pH 7.4。
[0028]更优选地，通过qPCR对筛选出的DNA编码化合物进行定量，如果定量分子数大于109，则将筛选出的DNA编码化合物替换步骤a中的DNA编码化合物库，然后重复步骤a至步骤d的操作，直至定量分子数在107‑
108。
[0029]本专利技术中所述的封闭片段是指与RNA靶标序列一致的长度为5～20nt的寡核苷酸片段。
[0030]显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0031]以下通过实施例形式的具体实施方式，对本专利技术的上述内容再作进一步地详细说明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。
附图说明
[0032]图1是本专利技术实施例1对于TAR RNA设计封闭片段序列1的示意图。
[0033]图2为实施例1中DNA标签中兼并序列不同富集程度的示意图。
[0034]图3为实施例2中DNA标签中兼并序列不同富集程度的示意图。
具体实施方式
[0035]本专利技术实施例中所使用的DNA编码化合物库来源于成都先导本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种DNA编码化合物库的RNA靶标筛选方法，其特征在于：筛选前在DNA编码化合物库中加入RNA靶标对应的封闭片段，然后进行筛选。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述封闭片段选自RNA片段、DNA片段和/或两者组合。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述RNA靶标对应的封闭片段的设计为：从RNA靶标序列的5
’
端开始截取5～20nt长度的序列为封闭片段序列1，随后以1～10nt长度的位移从5
’
端再截取5～20nt长度的序列为封闭片段序列2，直至全部截取，得到n种封闭片段序列1～n；优选地，截取长度为8～15nt，位移长度为2～6nt；更优选地，截取长度为12nt，位移长度为3nt。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：封闭片段序列1的截取需要覆盖RNA靶标中的第一个不配对的环形区域并超出3nt。5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述封闭片段的设计只覆盖RNA靶标的不配对的环形区域。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述封闭片段的设计覆盖RNA靶标的全部区域。7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述封闭片段的设计覆盖RNA靶标的60％以上的区域；优选地，覆盖70％以上的区域；更优选地，覆盖80％以上的区域。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：筛选前在DNA编码化合物库中加入RNA靶标对应的封闭片段的步骤为：向DNA编码化合物库中加入封闭片段序列1，混合均匀后静置，再加入封闭片段序列2，混合均匀后静置，直至加入封闭片段序列n，混合均匀后静置。9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述筛选方法步骤包括：a)筛选前在DNA编码化合物库中加入RNA靶标对应的封闭片段；b)将RNA靶标和已封闭的DNA编码化合物库进行孵育；c)固定RNA靶标，并进行洗脱；d)解离得到筛选出的DNA编码化合物。10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述筛选方法步骤包括：a)筛选前在DNA编码化合物库中加入RNA靶标对应的封闭片段；b)固定RNA靶标，将RN...

【专利技术属性】
技术研发人员：李进，陈秋霞，林春蓉，李游，窦登峰，
申请(专利权)人：成都先导药物开发股份有限公司，
类型：发明
国别省市：