一株内生球毛壳菌MG2及其在防治苹果树腐烂病的应用制造技术

本发明专利技术属于植物病害生物防治技术领域，公开了一株内生球毛壳菌MG2及其在防治苹果树腐烂病的应用，所述内生球毛壳菌MG2已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为：CGMCCNo.40070；所述内生球毛壳菌MG2是从健康木瓜海棠树皮中分离得到，经过鉴定确定为球毛壳菌，置于4℃小斜面保存。实验结果表明，本发明专利技术的内生球毛壳菌抑制了腐烂病菌的孢子萌发，发酵液具有良好的热稳定性；球毛壳菌发酵液具有良好的热稳定性和紫外线稳定性，可以应用于田间；球毛壳菌及其发酵液对苹果离体枝条均有一定的保护和治疗效果，但其保护作用优于治疗作用，为后期生产球毛壳菌预防保护制剂奠定基础。础。础。

An endophytic Chaetomium globosum Mg2 and its application in the control of Apple Tree Canker

【技术实现步骤摘要】
一株内生球毛壳菌MG2及其在防治苹果树腐烂病的应用


[0001]本专利技术属于植物病害生物防治
，尤其涉及一株内生球毛壳菌MG2及其在防治苹果树腐烂病的应用。

技术介绍

[0002]我国是世界第一苹果生产国，苹果产业是推进乡村振兴的重要支柱产业。然而，由真菌苹果黑腐皮壳(Valsa mali)引起的苹果树腐烂病却一直威胁着该产业的健康发展。腐烂病是苹果最具毁灭性的枝干病害，常造成枝枯树死，严重时甚至毁园，带来巨大的经济损失。目前，对于苹果树腐烂病的防治主要还依赖化学药剂，由于化学杀菌剂特别是内吸性杀菌剂长期而广泛的使用，导致病原菌抗药性问题日益突出。亟需通过综合防治尤其是与生物防治相结合，来克服其抗药性的问题，从而对苹果树腐烂病进行有效控制。但是，目前生物防治真菌资源多数尚处于研究与开发的初始阶段，远远满足不了生产上的实际要求。加之果品农药残留、生态环境污染等问题，不利于绿色食品的健康发展。因此大力开发生防微生物资源产品已势在必行。
[0003]通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：
[0004](1)由于化学杀菌剂特别是内吸性杀菌剂长期而广泛的使用，导致苹果树腐烂病菌抗药性增强、生态环境污染和农药残留等问题严重制约着绿色食品的健康发展。
[0005](2)目前生物防治真菌资源多数尚处于研究与开发的初始阶段，尤其缺乏特异性强、防治效果好的生防产品，远远满足不了生产上苹果树腐烂病防治的实际要求。

技术实现思路

[0006]针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一株内生球毛壳菌MG2及其在防治苹果树腐烂病的应用。
[0007]本专利技术是这样实现的，一株内生球毛壳菌MG2，所述内生球毛壳菌MG2已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为：CGMCC No.40070。
[0008]进一步，所述内生球毛壳菌MG2是从健康木瓜海棠(Chaenomeles cathayensis Schneid) 树皮中分离得到，经过鉴定确定为球毛壳菌，置于4℃小斜面保存。
[0009]本专利技术的另一目的在于提供一种实施所述的内生球毛壳菌MG2的内生球毛壳菌MG2的鉴定方法，所述内生球毛壳菌MG2的鉴定方法包括以下步骤：
[0010]步骤一，形态学观察：进行重新活化培养后的拮抗菌株MG2特征的观察；
[0011]步骤二，分子生物学鉴定：PCR扩增后构建多基因系统发育进化树。
[0012]进一步，所述步骤一中的形态学观察包括：
[0013]将平板对峙筛选得到的拮抗菌株MG2重新活化接于PDA培养基上，25℃培养箱中黑暗培养7d，观察生长速度、菌落颜色、形状以及闭囊壳形态特征。
[0014]其中，所述PDA培养基的制备方法为：称取去皮马铃薯200g，切成小块双蒸水煮沸至可戳散，四层纱布过滤煮沸液至1L的量杯，加入20g葡萄糖和15g琼脂搅拌均匀后双蒸水
定容至1L，封口121℃高压灭菌20min待用。
[0015]进一步，所述步骤二中的分子生物学鉴定包括：
[0016]将拮抗菌株MG2活化接于PDA培养基上，25℃培养箱中黑暗培养4d后转接到铺有玻璃纸的PDA培养基中，待菌落近似长满皿后，刮取菌丝提取菌株DNA，扩增ITS、LSU和 EF
‑
1α片段，将剩余PCR扩增产物进行测序；将测序结果序列与NCBI数据库中相关菌株进行BLAST比对分析，分别获得与拮抗菌株序列同源性高的相关菌株的ITS、LSU和EF
‑
1α序列；依次载入PhyloSuite软件中串联，在MEGA软件中基于邻接法(neighbor
‑
joining method, NJ)构建多基因系统发育进化树。
[0017]进一步，所述菌株活化及平板对峙试验包括：
[0018]菌株活化：在超净工作台中于4℃小斜面试管中挑少量菌丝，接种于PDA培养基上，25℃培养2～3d，完成活化。
[0019]平板对峙：采用两点对峙法明确球毛壳菌对苹果树腐烂病菌的拮抗作用。在PDA平板中央放置直径为5mm已活化的腐烂病菌菌饼，在距离病原菌菌饼左右各2.5cm处放置内生球毛壳菌菌饼，以单独放置病原菌菌饼的处理为对照。由于球毛壳菌生长速度比腐烂病菌慢，设置处理为优先接种球毛壳菌2d，1d，0d，分别标记为处理A、B、C，每个处理3个重复； 25℃黑暗培养，待对照近乎长满皿后，测量对照组菌落直径和处理组病原菌菌落朝球毛壳菌方向扩展的直径，按如下公式计算抑菌率：
[0020]抑菌率＝[(对照菌落直径
‑
病原菌菌落朝球毛壳菌方向扩展的直径)/对照菌落直径]×ꢀ
100％。
[0021]本专利技术的另一目的在于提供一种所述的内生球毛壳菌MG2在制备苹果树腐烂病防治用药物中的应用。
[0022]本专利技术的另一目的在于提供一种鉴定所述内生球毛壳菌MG2在制备苹果树腐烂病防治用药物中应用的方法，所述鉴定内生球毛壳菌MG2在制备苹果树腐烂病防治用药物中应用的方法包括：
[0023](1)鉴定球毛壳菌对苹果树腐烂病菌菌丝形态的影响；
[0024](2)球毛壳菌对苹果离体枝条和叶片的致病性检测；
[0025](3)确定球毛壳菌发酵液对苹果树腐烂病菌的抑制作用；
[0026](4)鉴定球毛壳菌发酵液对苹果树腐烂病菌菌丝形态的影响；
[0027](5)鉴定球毛壳菌发酵液对苹果树腐烂病菌孢子萌发的影响。
[0028]进一步，所述步骤(1)中的鉴定球毛壳菌对苹果树腐烂病菌菌丝形态的影响包括：
[0029]扫描电镜样品的制备：进行平板对峙培养2～3天后，用解剖刀切取正常生长的V.mali菌丝边缘为处理A，切取球毛壳菌拮抗后的V.mali菌丝边缘为处理B，放在4％(v/v)戊二醛磷酸缓冲液4℃下固定20h；用pH 6.8的PBS的缓冲液冲洗4次，每次间隔20min；样品经系列乙醇脱水、乙酸异戊酯置换、CO2临界点干燥、粘台、镀金后，在日立S
‑
4800场发射扫描电子显微镜下观察、拍照；其中，所述戊二醛磷酸缓冲液浓度为100mM，pH 6.8。
[0030]所述步骤(2)中的球毛壳菌对苹果离体枝条和叶片的致病性检测包括：
[0031]枝条处理：采集1～2年生富士苹果枝条，剪成10cm长短，挑选粗细长势一致的枝条，经清水冲洗干净，0.6％次氯酸钠溶液消毒15～20min后，无菌水再清洗3～4次直至无异味，晾干，用融化的石蜡封住枝条两端，静置晾干。
[0032]离体枝条试验：将处理好的枝条打孔，孔径5mm，接种V.mali菌饼作为处理组A，接种内生球毛壳菌MG2菌饼作为处理组B，接种空白PDA培养基菌饼作为对照组C，保鲜膜上喷水后密封保湿，25℃条件下培养5d，观察苹果树腐烂病的发生情况，每个处理9根枝条，每个枝条一个接种点，试验重复3次。
[0033]叶片处理：采集健康富士苹果叶片，挑选大小近似一致的叶片，具体清洗步骤同上本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种内生球毛壳菌MG2，其特征在于，所述内生球毛壳菌MG2已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为：CGMCC No.40070。2.如权利要求1所述内生球毛壳菌MG2，其特征在于，所述内生球毛壳菌MG2是从健康木瓜海棠树皮中分离得到，经过鉴定确定为球毛壳菌，置于4℃小斜面保存。3.一种实施如权利要求1～2任意一项所述内生球毛壳菌MG2的内生球毛壳菌MG2的鉴定方法，其特征在于，所述内生球毛壳菌MG2的鉴定方法包括以下步骤：步骤一，形态学观察：进行重新活化培养后的拮抗菌株MG2特征的观察；步骤二，分子生物学鉴定：PCR扩增后构建多基因系统发育进化树。4.如权利要求3所述内生球毛壳菌MG2的鉴定方法，其特征在于，所述步骤一中的形态学观察包括：将平板对峙筛选得到的拮抗菌株MG2重新活化接于PDA培养基上，25℃培养箱中黑暗培养7d，观察生长速度、菌落颜色、形状以及闭囊壳形态特征；其中，所述PDA培养基的制备方法为：称取去皮马铃薯200g，切成小块双蒸水煮沸至可戳散，四层纱布过滤煮沸液至1L的量杯，加入20g葡萄糖和15g琼脂搅拌均匀后双蒸水定容至1L，封口121℃高压灭菌20min待用。5.如权利要求3所述内生球毛壳菌MG2的鉴定方法，其特征在于，所述步骤二中的分子生物学鉴定包括：将拮抗菌株MG2活化接于PDA培养基上，25℃培养箱中黑暗培养4d后转接到铺有玻璃纸的PDA培养基中，待菌落近似长满皿后，刮取菌丝提取菌株DNA，扩增ITS、LSU和EF
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1α片段，将剩余PCR扩增产物进行测序；将测序结果序列与NCBI数据库中相关菌株进行BLAST比对分析，分别获得与拮抗菌株序列同源性高的相关菌株的ITS、LSU和EF
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1α序列；依次载入PhyloSuite软件中串联，在MEGA软件中基于邻接法构建多基因系统发育进化树。6.如权利要求4所述内生球毛壳菌MG2的鉴定方法，其特征在于，所述菌株活化及平板对峙试验包括：菌株活化：在超净工作台中于4℃小斜面试管中挑少量菌丝，接种于PDA培养基上，25℃培养2～3d，完成活化；平板对峙：采用两点对峙法明确球毛壳菌对苹果树腐烂病菌的拮抗作用；在PDA平板中央放置直径为5mm已活化的腐烂病菌菌饼，在距离病原菌菌饼左右各2.5cm处放置内生球毛壳菌菌饼，以单独放置病原菌菌饼的处理为对照；由于球毛壳菌生长速度比腐烂病菌慢，设置处理为优先接种球毛壳菌2d，1d，0d，分别标记为处理A、B、C，每个处理3个重复；25℃黑暗培养，待对照近乎长满皿后，测量对照组菌落直径和处理组病原菌菌落朝球毛壳菌方向扩展的直径，按如下公式计算抑菌率：抑菌率＝[(对照菌落直径
‑
病原菌菌落朝球毛壳菌方向扩展的直径)/对照菌落直径]
×
100％。7.一种如权利要求1～2任意一项所述内生球毛壳菌MG2在制备苹果树腐烂病防治用药物中的应用。8.一种鉴定如权利要求7所述内生球毛壳菌MG2在制备苹果树腐烂病防治用药物中应用的方法，其特征在于，所述鉴定内生球毛壳菌MG2在制备苹果树腐烂病防治用药物中应用的方法包括：
(1)鉴定球毛壳菌对苹果树腐烂病菌菌丝形态的影响；(2)球毛壳菌对苹果离体枝条和叶片的致病性检测；(3)确定球毛壳菌发酵液对苹果树腐烂病菌的抑制作用；(4)鉴定球毛壳菌发酵液对苹果树腐烂病菌菌丝形态的影响；(5)鉴定球毛壳菌发酵液对苹果树腐烂病菌孢子萌发的影响。9.如权利要求8所述鉴定内生球毛壳菌MG2在制备苹果树腐烂病防治用药物中应用的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的鉴定球毛壳菌对苹果树腐烂病菌菌丝形态的影响包括：扫描电镜样品的制备：进行平板对峙培养2～3天后，用解剖刀切取正常生长的V.mali菌丝边缘为处理A，切取球毛壳菌拮抗后的V.mali菌丝边缘为处理B，放在4％(v/v)戊二醛磷酸缓冲液4℃下固定20h；用pH 6.8的PBS的缓冲液冲洗4次，每次间隔20min；样品经系列乙醇脱水、乙酸异戊酯置换、CO2临界点干燥、粘台、镀金后，在日立S
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【专利技术属性】
技术研发人员：冯浩，渠非，黄丽丽，贺艳婷，苏晓州，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：