一种检测血红素、血红蛋白和/或L-半胱氨酸的生物传感器及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种检测血红素、血红蛋白和/或L

A biosensor for detecting heme, hemoglobin and / or L-cysteine and its application

【技术实现步骤摘要】
一种检测血红素、血红蛋白和/或L
‑
半胱氨酸的生物传感器及其应用


[0001]本专利技术属于生物传感及分析领域，具体涉及一种检测血红素、血红蛋白和/或L
‑
半胱氨酸的生物传感器及其应用。
[0002]
技术介绍

[0003]脱氧核酶（DNAzyme）是科学家研究发现的一类具有催化功能的核酸，迄今为止，已发现的DNAzyme有十余种，如具有RNA切割酶活性的8
‑
17、10
‑
23 DNAzyme，具有DNA切割酶活性的Cu
‑
DNAzyme，具有DNA连接酶活性的E47 DNAzyme，具有过氧化物酶活性的G
‑
四链体/血红素DNAzyme，以及可以修复胸腺嘧啶二聚体的UV1C DNAzyme等。其中，G
‑
四链体/血红素DNAzyme由于制备简单、性能稳定、价格低廉并且易修饰、易保存的优点得到研究者的高度青睐。G
‑
四链体/血红素DNAzyme 通常由富含G碱基的核酸序列在K
+
、Na
+
、NH
4+
等存在的条件下形成G
‑
四链体结构，然后结合血红素而构成。富G核酸序列可以是一条或两条含有重复串联G序列的单链DNA，在分子内或分子间形成由Hoogsteen氢键连接的环状G4片层，每个G4片层由4个G构成，两层或两层以上G4片层可进一步通过π
‑
π堆积形成G
‑
四链体。近年来，G
‑
四链体/血红素DNAzyme已被广泛用于生物传感、生物成像和疾病诊疗等领域。
[0004]血红素是一种重要的铁卟啉化合物，是血红蛋白、肌红蛋白、细胞色素、过氧化物酶、过氧化氢酶等的辅基，对于人体血液中O2的运输和细胞正常功能的维持具有关键作用。血红素的快速、灵敏、低成本检测在药物筛选、疾病诊断和法医鉴定等领域具有重要的实际应用价值。近年来，已报道的血红素检测方法主要有荧光分析法、比色分析法、化学发光法和电化学方法。其中，荧光分析法因灵敏度高、选择性好、操作方便等优点而被广泛应用。目前，以荧光为检测手段的血红素分析主要集中在两个方面：一是基于血红素对纳米材料的荧光猝灭效应实现特异性检测；二是基于富G核酸探针构建高灵敏度血红素检测策略。这些方法具有较好的抗干扰性能，但是灵敏度普遍较低。另外，需要先制备荧光纳米材料并对其形貌和性质进行表征，存在着过程繁琐、设备昂贵、成本高、耗时长等不足。相比而言，DNA合成和标记技术已非常成熟，利用带有标记基团的DNA，或借助DNA嵌入染料或过氧化物酶底物，可方便地构建血红素传感策略，因而在时间、成本、灵敏度等方面都具有明显优势。
[0005]血红蛋白是血液中红细胞的主要成分，负责细胞内氧气和二氧化碳的运输。人体内血红蛋白水平异常会导致严重的疾病，如地中海型贫血、白血病、心血管疾病和糖尿病等。目前，已报道的血红蛋白检测方法主要有电化学、表面等离子体共振和荧光法。其中，有的方法需要先用胰蛋白酶水解血红蛋白以使其血红素亚基暴露出来，然后通过检测血红素来实现血红蛋白的检测；有的方法基于血红蛋白对荧光的猝灭效应实现检测，这种“turn
‑
off”模式的光学检测存在的干扰因素较多，不利于复杂体系中的靶物质分析。因此，仍需发展简便、快速、灵敏的可直接检测血红蛋白的新方法。
[0006]半胱氨酸是生物体内的一种含有巯基的必需氨基酸，是构成蛋白质和酶功能部分
的重要氨基酸，在蛋白质合成和细胞还原过程中发挥重要作用。细胞内L
‑
半胱氨酸水平异常与多种疾病有关，如皮肤损伤、脑损伤、肝损伤和阿尔茨海默症等。目前，L
‑
半胱氨酸的检测方法主要有荧光、比色、电化学和电化学发光法。其中，新型的基于模拟过氧化物酶活性的L
‑
半胱氨酸检测受到了格外关注，研究人员已报道了利用氮硼硫共掺杂碳点、铁纳米粒@Co3O4中空纳米笼、FeMnO3纳米粒填充聚吡咯纳米管、Mo
6+
掺杂Co3O4纳米管等模拟过氧化物酶实现L
‑
半胱氨酸检测的方法。但这些方法一般由于操作复杂、成本高等缺点而受到限制。
[0007]
技术实现思路

[0008]解决的技术问题：针对上述技术问题，本专利技术提供了一种检测血红素、血红蛋白和/或L
‑
半胱氨酸的生物传感器及其应用，可实现对血红素、血红蛋白的“turn
‑
on”模式的光学检测以及L
‑
半胱氨酸的快速检测，相对于现有的检测方法具有更高的灵敏度，并且实验证明复杂血清体系中依然适用，有望为实际临床样品中血红素、血红蛋白以及L
‑
半胱氨酸的检测提供一种简便、快速、灵敏的方法。
[0009]技术方案：一种检测血红素、血红蛋白和/或L
‑
半胱氨酸的生物传感器，包括发夹核酸HP、结合缓冲溶液、血红素、TMB、H2O2和HAc
‑
NaAc缓冲溶液；所述发夹核酸HP的序列如SEQ No.1所示，其5
’
端标记有猝灭基团BHQ1，3
’
端标记有荧光基团FAM。
[0010]优选的，所述结合缓冲溶液包括：0.55 mM MgCl2，0.137 M NaCl，0.0027 M KCl，0.01 M Na2HPO4，0.0018 M KH2PO4，其pH为7.4。
[0011]优选的，所述发夹核酸HP由Tris
‑
HCl缓冲溶液配制而成，所述Tris
‑
HCl缓冲溶液包括10 mM Tris
‑
HCl，其pH为8.0。
[0012]优选的，所述HAc
‑
NaAc缓冲溶液包括0.2 M NaAc，0.3 M HAc，其pH 为4.2。
[0013]一种检测血红素或血红蛋白的方法，包括步骤如下：（1） 将发夹核酸HP加入结合缓冲溶液中形成核酸探针溶液；（2） 再将待测溶液加入核酸探针溶液中进行反应；（3） 反应完成后进行荧光光谱检测，激发波长为480 nm，并根据检测结果计算待测溶液中血红素或血红蛋白的浓度。
[0014]优选的，所述核酸探针溶液中发夹核酸HP的浓度为20 nM。
[0015]优选的，当待测溶液中不含血清时，血红素或血红蛋白的检测浓度范围为0~400 nM；当待测溶液中含有血清时，血红素或血红蛋白的检测浓度范围为20~400 nM。
[0016]一种检测L
‑
半胱氨酸的方法，包括步骤如下：（1） 将发夹核酸HP与血红素溶液混合反应；（2） 向步骤（1）所得溶液中加入待测溶液进行反应；（3） 向步骤（2）所得溶液中加入TMB、H2O
2 和HAc
‑
NaAc缓冲溶液进行反应；（4） 对步骤（3）所得溶液进行紫外
‑
可见吸收光谱本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测血红素、血红蛋白和/或L
‑
半胱氨酸的生物传感器，其特征在于，包括发夹核酸HP、结合缓冲溶液、血红素、TMB、H2O
2 和HAc
‑
NaAc缓冲溶液；所述发夹核酸HP的序列如SEQ No.1所示，其5
’
端标记有猝灭基团BHQ1，3
’
端标记有荧光基团FAM。2.根据权利要求1所述的检测血红素、血红蛋白和/或L
‑
半胱氨酸的生物传感器，其特征在于，所述结合缓冲溶液包括：0.55 mM MgCl2，0.137 M NaCl，0.0027 M KCl，0.01 M Na2HPO4，0.0018 M KH2PO4，其pH为7.4。3.根据权利要求1所述的检测血红素、血红蛋白和/或L
‑
半胱氨酸的生物传感器，其特征在于，所述发夹核酸HP由Tris
‑
HCl缓冲溶液配制而成，所述Tris
‑
HCl缓冲溶液包括10 mM Tris
‑
HCl，其pH为8.0。4.根据权利要求1所述的检测血红素、血红蛋白和/或L
‑
半胱氨酸的生物传感器，其特征在于，所述HAc
‑
NaAc缓冲溶液包括0.2 M NaAc，0.3 M HAc，其pH为4.2。5.利用权利要求1所述生物传感器检测血红素或血红蛋白的方法，其特征在于，包括步骤如下：（1）将发夹核酸HP加入结合缓冲溶液中形成核酸探针溶液；（...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘兴奋，王蕾，宋吉祥，黄艳琴，范曲立，
申请(专利权)人：南京邮电大学，
类型：发明
国别省市：