本发明专利技术属于分子生物学检测领域；具体地，涉及牛腹泻病原体的检测；更具体地，涉及用于检测沙门氏菌、魏氏梭菌、大肠杆菌K99、痢疾志贺氏菌、空肠弯曲杆菌、奇异变形杆菌共6种牛腹泻致病病原体的组合物。与此同时，还提供了包含所述组合物的试剂盒，所述组合物的用途，以及用于检测牛腹泻病原体并分型的方法。该组合物主要利用多重荧光PCR和熔解曲线分析方法在一管内进行检测，使得不同病原体能够得到区别对待，从而使得治疗和预防更有效。从而使得治疗和预防更有效。从而使得治疗和预防更有效。
Composition, kit, method and use for detecting and typing bovine diarrhea pathogens
【技术实现步骤摘要】
检测牛腹泻病原体并分型的组合物、试剂盒、方法及其用途
[0001]本专利技术属于分子生物学检测领域；具体地，涉及牛腹泻病原体的检测；更具体地，涉及沙门氏菌、魏氏梭菌、大肠杆菌K99、痢疾志贺氏菌、空肠弯曲杆菌、奇异变形杆菌共6种牛腹泻致病病原体的检测。
技术介绍
[0002]牛腹泻是由肠道内细菌、病毒、寄生虫等病原微生物或营养性因素、环境性因素等致使牛特别是犊牛免疫力低下所表现出来的一种征候群，临床表现为精神沉郁、食欲废食、高热、腹胀、腹痛、胃肠炎、腹泻、粪便恶臭、发黑、间或混有血丝气泡、脱水和酸中毒症状。造成牛腹泻特别是犊牛腹泻病因比较复杂，生物学因素、管理因素、环境因素、营养性因素均可导致本病的发生。其中病原微生物感染是造成牛腹泻的重要原因，如沙门氏菌、魏氏梭菌、大肠杆菌K99、痢疾志贺氏菌、空肠弯曲杆菌、奇异变形杆菌等均是引起牛腹泻的常见细菌。该病的发生严重影响着犊牛的生长发育和成年牛的生产性能，给养牛业造成巨大的经济损失。
[0003]目前来说，腹泻的病发主要关注于病毒性的感染，对于细菌性的感染则缺乏监控，这主要在于养殖过程中抗生素的大量使用是其主要的治疗与预防方式，随着国家推行的减抗、禁抗政策，以及精准用抗，本领域需求一种产品能够检测并区分不同细菌的感染，以便能够给予针对性的治疗，同时成本低，灵敏度高。
技术实现思路
[0004]有鉴于此，第一方面，本专利技术提供一种用于检测牛腹泻病原体并分型的组合物，所述组合物包括：第一核酸组合物：如SEQ ID NO:1所示的沙门氏菌上游引物、如SEQ ID NO:2所示的沙门氏菌下游引物，和如SEQ ID NO:3所示的沙门氏菌探针；如SEQ ID NO:4所示的魏氏梭菌上游引物、如SEQ ID NO:5所示的魏氏梭菌下游引物，和如SEQ ID NO:6所示的魏氏梭菌探针；如SEQ ID NO:7所示的大肠杆菌K99上游引物、如SEQ ID NO:8所示的大肠杆菌K99下游引物，和如SEQ ID NO:9所示的大肠杆菌K99探针；和如SEQ ID NO:10所示的痢疾志贺氏菌上游引物、如SEQ ID NO:11所示的痢疾志贺氏菌下游引物，和如SEQ ID NO:12所示的痢疾志贺氏菌探针。
[0005]进一步地，所述组合物还包括：第二核酸组合物：如SEQ ID NO:13所示的空肠弯曲杆菌上游引物，和如SEQ ID NO:14所示的空肠弯曲杆菌下游引物；和如SEQ ID NO:15所示的奇异变形杆菌上游引物，和如SEQ ID NO:16所示的奇异变
形杆菌下游引物。
[0006]本专利技术提供的检测牛腹泻病原体并分型的组合物，主要利用多重荧光PCR和熔解曲线分析方法，对沙门氏菌、魏氏梭菌、大肠杆菌K99、痢疾志贺氏菌、空肠弯曲杆菌、奇异变形杆菌多种病原体以及内标，在一管内进行检测，使得不同病原体能够得到区别对待，从而使得治疗和预防更有效。本专利技术的组合物，结合荧光探针熔解曲线法，其成本低，通量高。并且操作简便，结果读取过程通过Ct值和熔解峰Tm值即可以判定。
[0007]在一些实施方案中，本专利技术的组合物可以同时包括上述引物和探针中的一对或多对。在本专利技术中，“对”是指检测一个突变的互相匹配的上游、下游引物和探针。
[0008]举例来说，可以只包括第一核酸组合物；可以只包括第二核酸组合物。
[0009]举例来说，还可以只包括不同核酸组合物的一些引物和探针对，例如第一核酸组合物中的一对或多对，以及第二核酸组合物中的一对或多对。
[0010]进一步地，第一核酸组合物和第二核酸组合物均还可以包括用于检测内标的引物和/或探针。
[0011]在一个具体的实施方案中，第一核酸组合物进一步包括：如SEQ ID NO:17所示的内标上游引物，和如SEQ ID NO:18所示的内标下游引物。
[0012]进一步地，第一和第二核酸组合物每组之内的探针的荧光基团彼此互不相同且互不干扰。
[0013]在本文中，“互不相同且互不干扰”是指组合物中每个探针所用的荧光基团是不一样的，并且不会影响彼此的检测，即可以利用不同的通道进行检测。例如可以使用FAM、HEX、ROX和CY5，这些基团吸光值不接近，能选择不同的通道，因而不会互相干扰。
[0014]在一些具体的实施方案中，本专利技术组合物用于荧光PCR。
[0015]在本专利技术中，荧光报告基团可以选自FAM、HEX、ROX、VIC、CY5、5
‑
TAMRA、TET、CY3和JOE，但不限于此。
[0016]进一步地，探针的3
’
末端还具有淬灭基团，例如BHQ1或BHQ2或MGB。
[0017]在一个具体的实施方案中，探针的3
’
末端为BHQ1。
[0018]在一个具体的实施方案中，探针的3
’
末端为MGB。
[0019]进一步地，所述组合物中引物的用量为20nM~250nM；所述组合物中探针的用量为20nM~250nM。
[0020]在一个具体的实施方案中，本专利技术的组合物的各核酸组合物分别存在于单独包装中。
[0021]在一个具体的实施方案中，本专利技术的组合物的各核酸组合物存在于同一个包装中。
[0022]进一步地，本专利技术的组合物的每一核酸组合物中的各成分以混合的形式存在。
[0023]第二方面，本专利技术提供了上述本专利技术的组合物在制备检测牛腹泻病原体并分型的试剂盒中的用途。
[0024]第三方面，本专利技术提供了一种检测牛腹泻病原体并分型的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述本专利技术的组合物。
[0025]进一步地，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品。
[0026]进一步地，所述试剂盒还包括dNTP、PCR缓冲液以及Mg
2+
中的至少一种。
[0027]更进一步地，所述试剂盒还包括：核酸释放剂、核酸提取试剂、尿嘧啶糖基化酶以及DNA聚合酶中的至少一种。
[0028]更进一步地，所述试剂盒还包括核酸释放试剂、核酸提取试剂、dNTP、尿嘧啶糖基化酶、DNA聚合酶、PCR缓冲液以及Mg
2+
中的至少一种。
[0029]进一步地，所述DNA聚合酶的浓度为2U/反应~10U/反应，例如DNA聚合酶可以是Taq酶。
[0030]在一个具体的实施方案中，本专利技术试剂盒包括：Taq酶、尿嘧啶糖基化酶、Mg
2+
或Mn
2+
、dNTP、引物、探针和PCR缓冲液。
[0031]常见的PCR缓冲液由Tris
‑
HCl、MgCl2、KCl、Triton X
‑
100等缓冲体系构成。一般单个PCR反应管中总体积为20
µ
L~100
µ
L。
[0032]在一些具体的实施方案中，实时荧光PCR反应体系为表1在一个具体的实施方案中，本专利技术试剂盒可以兼容数字PCR扩增体系，即可以直接用本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种用于检测牛腹泻病原体并分型的组合物，其特征在于，所述组合物包括：第一核酸组合物：如SEQ ID NO:1所示的沙门氏菌上游引物、如SEQ ID NO:2所示的沙门氏菌下游引物，和如SEQ ID NO:3所示的沙门氏菌探针；如SEQ ID NO:4所示的魏氏梭菌上游引物、如SEQ ID NO:5所示的魏氏梭菌下游引物，和如SEQ ID NO:6所示的魏氏梭菌探针；如SEQ ID NO:7所示的大肠杆菌K99上游引物、如SEQ ID NO:8所示的大肠杆菌K99下游引物，和如SEQ ID NO:9所示的大肠杆菌K99探针；和如SEQ ID NO:10所示的痢疾志贺氏菌上游引物、如SEQ ID NO:11所示的痢疾志贺氏菌下游引物，和如SEQ ID NO:12所示的痢疾志贺氏菌探针。2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物进一步包括：第二核酸组合物：如SEQ ID NO:13所示的空肠弯曲杆菌上游引物，和如SEQ ID NO:14所示的空肠弯曲杆菌下游引物；和如SEQ ID NO:15所示的奇异变形杆菌上游引物，和如SEQ ID NO:16所示的奇异变形杆菌下游引物。3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述第二核酸组...
【专利技术属性】
技术研发人员：毛君杰，范文洲，王洁，汤睿，邱先锋，罗莎，戴立忠，
申请(专利权)人：湖南大圣宠医生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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