深海微杆菌SUC7及其产生的蔗糖磷酸化酶和应用制造技术

本发明专利技术涉及一种深海微杆菌SUC7及其产生的蔗糖磷酸化酶和应用，属于微生物领域，所述微杆菌（Microbacterium sp.）SUC7，保藏号为CCTCC NO：M 2022395。本发明专利技术还公开了利用所述深海微杆菌SUC7发酵产生的蔗糖磷酸化酶。所述蔗糖磷酸化酶能够以蔗糖和对苯二酚为底物，于30

Bacillus subtilis suc7 and its sucrose phosphorylase and its application

【技术实现步骤摘要】
深海微杆菌SUC7及其产生的蔗糖磷酸化酶和应用


[0001]本专利技术涉及一种深海微杆菌SUC7及其产生的蔗糖磷酸化酶和应用，属于海洋微生物


技术介绍

[0002]具有美白及保湿功效的抗坏血酸葡糖苷（AA
‑
2G）、熊果苷（Arbutin）和甘油葡糖苷（2
‑
α
‑
GG）价格昂贵，一般添加于高档化妆品中，限制了其广泛的应用。传统的制备方法集中于化学合成和天然材料提取，其中提取法因原材料的限制，难以可持续发展和降低成本；化学合成虽然生产效率高，但容易引入一些化学异构成分和有机溶剂等杂质，造成其后续纯化工艺复杂，提高了其生产成本。随着酶学和合成生物学的发展，通过蔗糖磷酸化酶酶法转化生产成为一条可持续、绿色的制备工艺。酶法转化具有反应条件温和、不会出现异构成分和引入有机溶剂等杂质的优点，因此越来越受到重视。
[0003]海洋微生物因其生活环境的独特性及环境适应性，故作为产酶微生物资源具有显著的优势：耐压，耐碱，耐盐，耐冷，物种多样性，代谢易调控，低温下有较高活性等特性，赋予海洋微生物酶广泛的应用前景。因此从海洋环境筛选高产蔗糖磷酸化酶的菌株，是今后研究和开发新型蔗糖磷酸化酶的关键。

技术实现思路

[0004]本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种新的能产蔗糖磷酸化酶的来自海洋的微杆菌SUC7。
[0005]本专利技术要提供的另一个技术问题是提供上述来自海洋的微杆菌SUC7产的蔗糖磷酸化酶的方法和应用。
>[0006]本专利技术是通过如下技术方案来实现的：一种深海微杆菌（Microbacterium sp.）SUC7，其菌株保藏号为CCTCC NO：M 2022395。
[0007]本专利技术所涉及的菌株SUC7是来自马里亚纳海沟深海沉积物中分离筛选到的微杆菌属SUC7（Microbacterium sp.SUC7），该菌株已于2022年4月8日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国湖北省武汉市武昌区八一路299号，电话：(027)
‑
6875 2319。
[0008]本专利技术还公开了利用所述微杆菌（Microbacteriumsp.）SUC7产生的蔗糖磷酸化酶。
[0009]本专利技术还提供所述蔗糖磷酸化酶的制备方法，所述方法为接微杆菌SUC7到液体种子培养基(pH＝7.0)中，在20
‑
25℃、摇床恒温培养18
‑
24h后，取培养液按照接种量体积比5
‑
10％接入液体发酵培养基中，摇床恒温20
‑
25℃培养24
‑
48h，离心收集菌体，重悬后破碎菌体，离心得到上清液即为蔗糖磷酸化酶粗酶液。
[0010]进一步，所述液体种子培养基配方为：牛脑12.5g、牛心浸出汁5.0g、蛋白胨10.0g、葡萄糖2.0g、氯化钠5.0g、磷酸氢二钠2.5g、蒸馏水1000ml、pH 6.8
‑
7.2。液体发酵培养基的
配方为：胰蛋白胨1.0g、酵母提取物0.5g、蔗糖5.0g、氯化钠 5.0g、蒸馏水1000ml、pH 6.8
‑
7.2。
[0011]上述蔗糖磷酸化酶具有如下酶学性质：最适反应温度为50℃，在30
−
50℃时该酶表现出高于其最高酶活性的80%。
[0012]本专利技术还提供了所述蔗糖磷酸化酶制备α
‑
熊果苷的应用，所述应用方法为以蔗糖和对苯二酚为底物，加入蔗糖磷酸化酶粗酶液，反应体系放置于30
‑
50℃下充分避光反应24
ꢀ‑
48h，沸水浴终止反应，过滤后，即可得到α
‑
熊果苷反应液。
[0013]进一步，所述蔗糖和对苯二酚在反应体系中的质量比为15:1
‑
50:3。
[0014]进一步，蔗糖磷酸化酶粗酶液的酶活力为100
‑
300 U/mL。
[0015]进一步，所述反应体系包括MES
‑
NaOH缓冲液。
[0016]本专利技术与现有技术相比的有益效果：本专利技术提供了一种新的从马里亚纳海沟沉积物样品中筛选到的高产蔗糖磷酸化酶的海洋微生物菌株微杆菌SUC7，并公开了其产酶的方法。该菌株为首次报道的具有产蔗糖磷酸化酶酶活性的微杆菌属微生物，本专利技术有效地拓宽了蔗糖磷酸化酶的来源。本专利技术所产蔗糖磷酸化酶具有较优的酶性质，最适反应温度50℃，高于常见的肠膜明串珠菌ATCC 12291蔗糖磷酸化酶（35℃）；利用该菌产生的蔗糖磷酸化酶转化制备α
‑
熊果苷，其产量可达到33.2g/L，具有广泛的应用前景。
附图说明
[0017]图1为蔗糖磷酸化酶的最适反应温度图；图2为α
‑
熊果苷标准品液相图；图3为对苯二酚标准品液相图；图4为α
‑
熊果苷标准曲线图；图5为α
‑
熊果苷反应液液相图。
具体实施方式
[0018]下面结合具体实例，进一步描述本专利技术的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本专利技术，而不构成对其权利的限制。实施例中所用到的培养基：液体种子培养基：牛脑12.5g、牛心浸出汁5.0g、蛋白胨10.0g、葡萄糖2.0g、氯化钠5.0g、磷酸氢二钠2.5g、蒸馏水1000ml、pH 6.8
‑
7.2。
[0019]固体种子培养基：牛脑12.5g、牛心浸出汁5.0g、蛋白胨10.0g、葡萄糖2.0g、氯化钠5.0g、磷酸氢二钠2.5g、琼脂30g、蒸馏水1000ml、pH 6.8
‑
7.2。
[0020]液体发酵培养基：胰蛋白胨1.0g、酵母提取物0.5g、蔗糖5.0g、氯化钠 5.0g、蒸馏水1000ml、pH 6.8
‑
7.2。
[0021]实施例1称取1g马里亚纳海沟深海沉积物样品放入50ml 液体种子培养基中，25℃、180r/min培养1
‑
3d。选取培养液的稀释液涂布固体种子培养基（3%琼脂的液体种子培养基）中，25℃培养1
‑
2d，菌落长出后挑取单菌落，接种于液体发酵培养基中，25℃培养1
‑
2d，离心收集菌体，重悬后破碎菌体，进行蔗糖磷酸化酶活性测定，选取酶活力较高的菌株，命名为SUC7。
用细菌基因组提取试剂盒提取SUC7的基因组，选用扩增原核微生物16S rDNA序列的通用引物(27F：5
’‑
AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
‑3’
和1492R：5
’‑
GGTTACCTTGTTACGACTT
‑3’
)进行聚合酶链式反应。反应体系：Taq plus ploymerase(0 .4μl)，上下游引物(各1μl)，dNTP(1μl)，PCR Buffer(2μl)本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种深海微杆菌SUC7，微杆菌的拉丁文为Microbacterium sp.，其特征在于，所述深海微杆菌SUC7的保藏号为CCTCC NO：M 2022395。2.一种蔗糖磷酸化酶，其特征在于，所述蔗糖磷酸化酶由权利要求1所述深海微杆菌SUC7产生。3.一种蔗糖磷酸化酶的制备方法，其特征在于，所述方法为将权利要求2所述深海微杆菌SUC7接种到pH7.0的液体种子培养基中，在20
‑
25℃、摇床恒温培养18
‑
24h后，取培养液按照接种量体积比5
‑
10％接入液体发酵培养基中，摇床恒温20
‑
25℃培养24
‑
48h，离心收集菌体，重悬后破碎菌体，离心得到上清液即为蔗糖磷酸化酶粗酶液。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述液体种子培养基组分及含量为：在1000ml液体种子培养基中含有牛脑12.5g、牛心浸出汁5.0g、蛋白胨10.0g、葡萄糖2.0g、氯化钠5.0g和磷酸氢二钠2.5g，液体种...

【专利技术属性】
技术研发人员：郝建华，王伟，孙晶晶，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：