蜻蜓凤梨AfFT3基因、克隆方法、表达载体及应用技术

本发明专利技术公开蜻蜓凤梨AfFT3基因、克隆方法、表达载体及应用，提取蜻蜓凤梨总RNA，反转录合成cDNA，以此为模板，设计特异引物，利用PCR方法获得AfFT3基因的全长cDNA，与载体连接，转化大肠杆菌Trans

Dragonfly pineapple afft3 gene, cloning method, expression vector and Application

【技术实现步骤摘要】
蜻蜓凤梨AfFT3基因、克隆方法、表达载体及应用


[0001]本专利技术属于生物
，涉及凤梨FT基因、克隆、表达特性分析、表达载体构建、对乙烯的响应途径和对开花的调控作用。

技术介绍

[0002]凤梨科植物为多年生单子叶草本植物，包括重要的热带花卉(观赏凤梨)和重要的热带水果(菠萝)。为了满足市场需求，利用乙烯及其衍生物促进凤梨开花，调节上市时间，已经成为凤梨栽培中采用的重要技术。但实际生产中常有催花质量不佳造成经济损失的情况发生，解决这一问题的理论依据匮乏。已有的研究表明，外源乙烯通过提高内源乙烯的含量诱导凤梨植物开花，而内源乙烯如何启动开花仍是未解问题。
[0003]FLOWERING LOCUS T(FT)是调控植物开花的重要基因，对成花转变具有重要作用，是典型的促花因子。FT属于磷脂酰乙醇胺结合蛋白(phosphatidylethanolamine
‑
binding protein,PEBP)家族基因，本身受光周期途径中的锌指蛋白诱导，其蛋白由叶片经维管束移动到茎顶端组织。FT是光周期途径关键基因CONSTANS(CO)、春化途径和自主途径关键基因FLOWERING LOCUS C(FLC)等的直接靶基因，它几乎可将所有的开花信号传导途径进行整合。研究表明，拟南芥FT在接收到光周期信号后，先从叶片中被诱导表达，然后FT蛋白在FT
‑
INTERACTING PROTEIN 1(FTIP1)蛋白的协助下，经过维管束转运至顶端分生组织(shoot apical meristem，SAM)，并与FLOWERING LOCUS D(FD)相互作用形成FT
‑
FD蛋白复合体，从而激活下游的花分生组织决定基因，例如APETALA 1(AP1)和FRUITFULL(FUL)，从而诱导开花。乙烯是最早发现的一种具有生物活性的植物激素，可以调节植物的生长发育和各种生理活动。根据乙烯特有的“三重反应”，研究人员在近几十年中对植物乙烯信号通路中的关键组分进行了筛选、分离及鉴定，最终构建了乙烯信号转导通路的基本模型。乙烯信号是被膜结合蛋白(乙烯受体)所感知。但FT基因是否响应乙烯信号并进一步调控植物开花的相关研究尚处于初始阶段。目前，关于凤梨科植物FT基因作用及其功能的报道也较少。
[0004]通过蜻蜓凤梨(Aechmea fasciata)比较转录组信息分析获得了FT基因的片段，BLAST对比显示均与其他植物中的FT基因具有较高的同源性，定名为AfFT3。实时荧光定量PCR结果表明，外源乙烯和不同温度处理凤梨后，AfFT3基因的表达量明显提高。利用PCR克隆了基因的全长序列并构建表达载体，在拟南芥中过表达后抑制了拟南芥开花。利用酵母单杂技术，表明乙烯信号途径基因EIN3蛋白可直接结合到AfFT3的启动子，诱导AfFT3的表达。说明，蜻蜓凤梨AfFT3基因具有响应外源乙烯及温度并抑制开花的功能。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种蜻蜓凤梨AfFT3基因，提取蜻蜓凤梨总RNA，反转录合成cDNA，以此为模板，设计特异引物，利用PCR方法获得AfFT3基因的全长cDNA，与载体连接，转化大肠杆菌Trans
‑
T1感受态细胞，挑取阳性克隆得到蜻蜓凤梨AfFT3基因，该基因的cDNA全长570bp。AfFT3基因的获得，为研究蜻蜓凤梨乙烯诱导开花
机理奠定了基础，为凤梨植物栽培中乙烯催花技术的提高提供了理论参考，具有重要的理论及实践意义。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术的技术方案为：提供一种蜻蜓凤梨AfFT3基因，该基因序列具有序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
[0007]本专利技术的另一目的在于提供一种蜻蜓凤梨AfFT3基因的克隆方法，包括以下步骤：
[0008](1)以蜻蜓凤梨(Aechemia fasciata)为材料，利用CTAB法提取总RNA；
[0009](2)AfFT3基因的克隆；
[0010](2
‑
1)利用Uni One
‑
Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(Transgene)试剂盒将RNA反转录为cDNA，作为PCR模板备用；
[0011](2
‑
2)设计全长cDNA扩增引物；
[0012]AfFT3基因cDNA全长克隆引物
[0013][0014](2
‑
3)根据引物的Tm值进行PCR条件的优化后，进行PCR扩增，并将获得的产物连接到载体，并转化大肠杆菌感受态Trans
‑
T1，经PCR和酶切鉴定后进行测序。
[0015]PCR体系及条件为：
[0016][0017][0018]获得全长的cDNA为570bp，包括部分起始密码子前的5
’
UTR和终止密码子后的3
’
UTR。开放阅读框部分为465bp，由此推得编码含155个氨基酸残基的蛋白质，将此氨基酸序列在国际基因库中进行保守结构域分析，表明其具有PEBP家族保守功能结构域。
[0019]进一步地，步骤(1)总RNA的提取具体如下：
[0020](1
‑
1)准备工作：将研钵提前放入烘箱180℃烘4h后冷却至室温待用，实验过程中所要用的移液枪、实验台均用酒精擦拭，离心管、枪头均无RNA酶。
[0021](1
‑
2)取850μl CTAB缓冲液到2ml离心管中，放入65℃水浴锅预热。
[0022](1
‑
3)称取0.2g材料于加入液氮的研钵中充分研磨，待材料呈粉末状即可转入(1
‑
2)中预热的离心管中，加入材料前先加入25μlβ
‑
巯基乙醇。
[0023](1
‑
4)立即涡旋30s混匀，65℃水浴6min。
[0024](1
‑
5)加入等体积氯仿、异戊醇(24:1)，剧烈震荡，开盖放气，涡旋30s，室温11000rpm离心15min。
[0025](1
‑
6)吸取上清于新2ml离心管中，加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)再抽提一次，涡旋30s，室温11000rpm离心15min。
[0026](1
‑
7)吸取上清于新1.5ml离心管中，加入1/3体积8mol/l LiCl，颠倒混匀，在4℃下沉淀10
‑
12h，不要超过16h。
[0027](1
‑
8)4℃下，11000rpm离心30min，弃上清，用75％乙醇500μl洗涤沉淀两次，弃去液体，风干。
[0028](1
‑
9)加入30
‑
40μl RNase
‑
free水溶解沉淀。
[0029](1
‑
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种蜻蜓凤梨AfFT3基因，其特征在于：该基因序列具有序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。2.一种蜻蜓凤梨AfFT3基因的克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)以蜻蜓凤梨为材料，利用CTAB法提取总RNA；(2)AfFT3基因的克隆；(2
‑
1)利用Transgene公司的
‑
Uni One
‑
Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix Kit将RNA反转录为cDNA，作为PCR模板备用；(2
‑
2)设计全长cDNA扩增引物；(2
‑
3)根据引物的Tm值进行PCR条件的优化后，进行PCR扩增，并将获得的产物连接到大肠杆菌，经PCR和酶切鉴定后进行序列测定。3.根据权利要求2所述的蜻蜓凤梨AfFT3基因的克隆方法，其特征在于，步骤(1)总RNA的提取具体如下：(1
‑
1)准备工作：将研钵提前放入烘箱180℃烘4h后冷却至室温待用，实验过程中所要用的移液枪、实验台均用酒精擦拭，离心管、枪头均无RNA酶；(1
‑
2)取850μl CTAB缓冲液到2ml离心管中，放入65℃水浴锅预热；(1
‑
3)称取0.2g材料于加入液氮的研钵中充分研磨，待材料呈粉末状即可转入(1
‑
2)中预热的离心管中，加入材料前先加入25μlβ
‑
巯基乙醇；(1
‑
4)立即涡旋30s混匀，65℃水浴6min；(1
‑
5)加入等体积氯仿/异戊醇，剧烈震荡，开盖放气，涡旋30s，室温11000rpm离心15min；(1
‑
6)吸取上清于新2ml离心管中，加入等体积氯仿/异戊醇再抽提一次，涡旋30s，室温11000rpm离心15min；(1
‑
7)吸取上清于新1.5ml离心管中，加入1/3体积8mol/l LiCl，颠倒混匀，在4℃下沉淀10
‑
12h，不要超过16h；(1
‑
8)4℃下，11000rpm离心30min，弃上...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐立，荆永琳，李志英，王小冰，王加宾，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所，
类型：发明
国别省市：