一种巴戟天毛状根遗传转化体系的建立方法技术

一种巴戟天毛状根遗传转化体系的建立方法，以巴戟天无菌组培苗的幼嫩茎段作为外植体，经预培养后转移到侵染液中，侵染结束后将外植体表面的菌液吸干，然后进行共培养，将在共培养过程中形成菌斑的外植体用含有头孢噻肟钠和特美汀的无菌水清洗，清洗完的外植体转接到含有头孢噻肟钠、特美汀和乙酰丁香酮的1/2 MS固体培养基上诱导毛状根；当毛状根长到2～3 cm左右时，将毛状根剪下并转移到含有筛选抗生素的1/2 MS固体培养基上，筛选出具有卡那霉素抗性且生长速度快、分支较多的毛状根发根系。本发明专利技术具有较高转化效率，为后续的基因功能研究及利用基因工程手段提高巴戟天药效活性成分的含量提供良好的技术支撑。性成分的含量提供良好的技术支撑。性成分的含量提供良好的技术支撑。

【技术实现步骤摘要】
一种巴戟天毛状根遗传转化体系的建立方法


[0001]本专利技术属于植物基因工程领域，具体涉及一种巴戟天毛状根遗传转化体系的建立方法。

技术介绍

[0002]巴戟天（Morinda officinalis How）为茜草科巴戟天属多年生藤本植物，以根入药，具有补肾阳、抗骨质疏松、抗抑郁、抗炎镇痛和祛风除湿的作用。临床上，常用巴戟天配伍其他药物治疗肾虚、骨质疏松症和风湿痹痛，例如金刚丸、巴戟丸、二仙汤、仙藤汤和三藤汤等。
[0003]发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）是根瘤菌科农杆属的一种革兰氏阴性土壤细菌，能够侵染大多数双子叶植物、少数单子叶植物以及个别裸子植物。发根农杆菌中起关键作用的是其携带的Ri质粒，含有负责发根自主性生长和冠瘿碱合成的基因。Ri质粒在结构上与Ti质粒类似，主要有致毒区（Vir），T
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DNA区以及冠瘿碱合成功能区等。根据合成冠瘿碱的不同，Ri质粒分为4种类型：1）甘露碱型；2）黄瓜碱型；3）农杆碱型；4）米奇矛型。发根农杆菌菌株ATCC15834来源于American 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种巴戟天毛状根遗传转化体系的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）外植体的预培养：以巴戟天无菌组培苗的幼嫩茎段作为外植体，置于含有80～120 μM乙酰丁香酮的MS固体培养基中，22～28℃暗培养2～3 d；（2）侵染液配制：将含有目的基因的植物表达载体转化至发根农杆菌，并且制备成侵染液；（3）发根农杆菌的侵染：将预培养后的茎段转移到步骤（2）得到的侵染液中，25～30℃、50～100 r/min震荡10～30 min，使预培养的外植体与发根农杆菌之间充分接触；（4）共培养：侵染结束后，用无菌滤纸将外植体表面的菌液吸干，然后转接到含有80～120 μM 乙酰丁香酮的MS 固体培养基中，22～28 ℃暗培养条件下共培养2～3 d；（5）洗菌：将在共培养过程中形成菌斑的外植体用含有250～350 mg/L头孢噻肟钠和150～250 mg/L特美汀的无菌水清洗2～3 次，然后用无菌滤纸吸干外植体表面的水分；（6）毛状根的诱导：将清洗完的外植体转接到含有250～350 mg/L 头孢噻肟钠、150～250 mg/L 特美汀和80～120 μM 乙酰丁香酮的1/2 MS 固体培养基上，置于28℃的恒温培养箱中；每隔一周继代培养一次，逐渐降低除菌抗生素的浓度，直至外植体周围的菌斑完全消失；（7）阳性毛状根的筛选：当诱导出来的毛状根长到 2～3 cm左右时，将毛状根剪下并转移到含有筛选抗生素的1/2 MS 固体培养基上，25～30 ℃暗培养，筛选出具有卡那霉素抗性且生长速度快、分支较多的毛状根发根系。2.如权利要求1所述的巴戟天毛状根遗传转化体系的建立方法，其特征在于，步骤（1）所述外植体来自巴戟天的无菌组培苗，幼嫩茎段为组培苗植株上部2～3片叶以上的茎段，沿幼嫩茎段斜下30度角轻轻划伤茎段表层，不要划断茎段。3.如权利要求1所述的巴戟天毛状根遗传转化体系的建立方法，其特征在于，步骤（2）所述的侵染液配制方法如下：a. 通过冻融法将含目的基因的植物表达载体转化至发根农杆菌ATCC15834；b. 在无菌操作台中，用接种环挑取上述转化后的发根农杆菌ATCC15834，划线到含40～60 mg/L 卡那霉素的YEP 固体培养基，于25～...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐世强，王继华，杨少海，
申请(专利权)人：广东省农业科学院作物研究所，
类型：发明
国别省市：