一种用于检测G-CSFR的流式检测试剂及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供一种用于检测G

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测G
‑
CSFR的流式检测试剂及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及医学诊断
，具体涉及用于检测G
‑
CSFR的流式检测试剂及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor，G
‑
CSF)是由单核细胞和巨噬细胞产生的一种细胞生长因子，通过与效应细胞表面特异性受体G
‑
CSFR结合，激活复杂的信号转导系统，发挥多种生物学功能，包括调节髓系细胞的增殖、分化与存活。目前，在临床上G
‑
CSF广泛应用于粒细胞减少性疾病及化疗后粒细胞缺乏的病征，G
‑
CSF也是自体或异基因移植时外周血干细胞强有力的动员剂，而且G
‑
CSF联合化疗的预激方案在治疗难治、复发、老年的急性髓系白血病及骨髓增生异常综合症中也取得良好疗效。
[0003]G
‑
CSFR是一种高亲和力受体，分布于髓系定向造血祖细胞、中性粒细胞、内皮细胞、髓系白血病细胞、部分幼稚淋巴细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞以及某些非造血细胞。正常情况下，G
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CSFR与G
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CSF结合，能够促进髓系前体细胞的生长和维持，促使髓细胞最终分化成粒细胞。但G
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CSFR的异常表达、基因突变等会导致G
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CSF的信号转导紊乱，通常与恶性先天性中性粒细胞减少症、急性髓系白血病、慢性中性粒细胞白血病、非典型慢性粒细胞白血病等疾病的发生、发展密切相关。近年来，随着分子遗传学以及临床研究的深入，对于G
‑
CSFR的异常表达或基因突变在相关血液病发病以及治疗中的具体作用的研究取得较多新进展。但是，由于检测手段的局限、患者的多样性、血液肿瘤细胞的生物学及遗传学的异质性等因素，有关G
‑
CSFR的一些研究报道尚存在争议，G
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CSFR与临床诊断、治疗以及预后的关系尚待深入的探讨。
[0004]流式技术是经典的单细胞检测技术，能够对细胞表面标志物进行多参数检测。传统流式使用荧光基团偶联抗体，基于抗体与细胞表面抗原特异性结合的特性，利用荧光光路，检测细胞表面标志物。但是该技术也有局限，即细胞表面抗原产生突变，则可能导致其与相应抗体结合失效，致使流式技术无法检测出细胞表面标志物与抗体结合的信号。目前市场上的流式检测试剂均为抗体制备，均无法避免抗原突变问题，这极大的限制了医学研究及临床应用。

技术实现思路

[0005]本专利技术针对上述现有技术中存在的技术问题，提供了一种以细胞因子G
‑
CSF为基础的检测G
‑
CSFR的流式检测试剂。细胞因子多为低分子质量的蛋白质或糖蛋白，与细胞因子受体间呈高亲和力，是抗原抗体亲和力的100
‑
1000倍，且两者之间的结合是完整结合，受体发生突变对两者之间结合并无影响。该试剂很好的弥补了现有流式检测以抗体为主的缺陷，填补了现有技术空白，具有良好的应用前景。
[0006]本专利技术首先提供了一种用于检测G
‑
CSFR的流式检测试剂，有效成分为连接有荧光素的人源重组G
‑
CSF；所述荧光素选自异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)或别藻蓝蛋白
(APC)中的任一种。
[0007]在根据本专利技术的一个实施方案中，所述人源重组G
‑
CSF的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
[0008]序列SEQ ID NO:1
[0009][0010]在根据本专利技术的一个实施方案中，还包含溶剂，所述溶剂为PBS。
[0011]本专利技术还提供了上述的流式检测试剂的制备方法，包括：
[0012]1)将FITC试剂与MES混合，混匀后得到FITC浓度为10mg/mL的混合液；
[0013]2)向所述混合液中加入过量的EDC和NHS，混匀并于室温反应15min；
[0014]3)加入巯基乙醇，终止EDC活化反应，并调pH至7.2，得到活化的混合液；
[0015]4)将重组人源G
‑
CSF蛋白加入到所述活化的混合液中，充分混匀，于室温反应2h；所述G
‑
CSF蛋白与FITC的摩尔比1：1。
[0016]5)加入适量的盐酸羟胺，然后于1
×
PBS中透析过夜，即得。
[0017]本专利技术进一步提供了一种用于检测G
‑
CSFR的试剂盒，其包含上述的检测试剂。
[0018]本专利技术的上述技术方案的有益效果如下：
[0019]本专利技术提供的用于检测G
‑
CSFR的检测试剂与CD114抗体的检测效果相当，准确检测细胞表面的G
‑
CSFR。同时，本专利技术提供的弥补了现有流式检测以抗体为主的缺陷，填补了现有技术空白，具有良好的应用前景。
附图说明
[0020]图1为利用G
‑
Reagent对正常造血干细胞和白血病细胞的检测结果图谱；
[0021]图2为G
‑
Reagent与CD114检测效果对比图谱；
[0022]图3为AML患者CD34+恶性原始细胞表面CD114和G
‑
CSFR表达图谱；
[0023]图4为T
‑
检验统计G
‑
Reagent和CD114检测G
‑
CSFR之间差异的相关图谱。
具体实施方式
[0024]为使本专利技术要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。
[0025]试剂与仪器
[0026]重组人源G
‑
CSF(购于厦门特宝生物工程有限公司)
[0027]FITC(异硫氰酸荧光素)(北京索莱宝公司)
[0028]MES(吗啉乙磺酸)(北京索莱宝公司)
[0029]NHS(N
‑
羟基琥珀酰亚胺)(北京索莱宝公司)
[0030]EDC(1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐)(北京索莱宝公司)
[0031]NaHCO3(北京索莱宝公司)
[0032]盐酸羟胺(北京索莱宝公司)
[0033]红细胞裂解液(美国库尔特
‑
贝克曼公司)
[0034]细胞株K562(重庆医科大学检验医学院培养和储存)
[0035]抗体CD114(美国Biolegend公司)
[0036]流式细胞仪(美国库尔特
‑
贝克曼公司)
[0037]实施例1G
‑
Reagent制备
[0038]以重组人G本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测G
‑
CSFR的流式检测试剂，其特征在于，有效成分为连接有荧光素的人源重组G
‑
CSF；所述荧光素选自异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)或别藻蓝蛋白(APC)中的任一种。2.如权利要求1所述的流式检测试剂，其特征在于，所述人源重组G
‑
CSF的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。3.如权利要求1或2所述的流式检测试剂，其特征在于，还包含溶剂，所述溶剂为PBS。4.如权利要求1
‑
3中任一项所述的流式检测试剂的制备方法，其特征在于，包括：1)将FITC试剂与MES混合，混匀后得到...

【专利技术属性】
技术研发人员：张颖，娄世锋，王滕，白凤霞，张萍，
申请(专利权)人：重庆医科大学附属第二医院，
类型：发明
国别省市：