【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于基于位点特异性tau磷酸化的诊断和治疗的基于血液的测定
[0001]相关申请的交叉引用本申请要求2019年9月10日提交的美国临时申请号62/898,407的优先权,所述申请的公开内容通过引用并入本文。
[0002]政府权利本专利技术是在美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的NS095773下在政府支持下完成的。美国政府拥有本专利技术的某些权利。
[0003]对序列表的引用本申请含有已通过EFS
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Web以ASCII格式提交且据此通过引用整体并入的序列表。所述ASCII副本于2020年9月10日创建,名为665441_ST25.txt,且大小为24 KB字节。
技术介绍
[0004]微管相关蛋白tau (MAPT或tau)在神经元的形态学和生理学方面起着重要作用。tau具有全长蛋白的六种不同同种型,并经历许多可能的翻译后修饰,包括乙酰化、糖基化和磷酸化。磷酸化对于调节tau在轴突稳定中的正常功能是重要的,并且可以在超过80个不同残基上发生。但是,tau的过度磷酸化似乎增加了tau聚集成主要由超磷酸化tau组成的细胞内不溶性成对螺旋丝(PHF)和神经原纤维缠结(NFT)的可能性。
[0005]tau是阿尔茨海默氏病(AD)缠结和神经突病理的主要组分。AD CSF中总tau (t
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tau)和一些磷酸化tau (p
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tau)同种型水平显著增加。然而,血浆tau和CSF tau水平之间差的关联一直是开发血浆ta
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于处理血液样品以富集可溶性tau的方法,所述方法包括:使用高氯酸从血液样品中沉淀蛋白质,从而产生血液的酸溶性提取物;和通过使用反相吸附剂的固相萃取和使用一种或多种表位结合剂的亲和纯化来浓缩酸溶性提取物中的可溶性tau,其中至少一种表位结合剂特异性结合在tau的N末端内或在tau的中间结构域内的表位。2.权利要求1的方法,其中血液样品是血浆。3.权利要求1的方法,其中血液样品是血清。4.前述权利要求中任一项的方法,其中将高氯酸添加到约1% v/v至约15% v/v的最终浓度。5.权利要求4的方法,其中将高氯酸添加到约3% v/v至约15% v/v或约3% v/v至约10% v/v的最终浓度。6.权利要求4的方法,其中将高氯酸添加到约3% v/v至约5% v/v的最终浓度。7.前述权利要求中任一项的方法,其中反相吸附剂是包含N
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乙烯基吡咯烷酮和二乙烯基苯的聚合物或包含苯乙烯和二乙烯基苯的聚合物。8.权利要求7的方法,其中反相吸附剂是包含N
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乙烯基吡咯烷酮和二乙烯基苯的聚合物。9.权利要求7的方法,其中固相萃取使用包含约0.05% v/v至约1% v/v TFA的流动相。10.权利要求9的方法,其中固相萃取使用包含约0.05% v/v至约0.5% v/v TFA或约0.1% v/v TFA至约1% v/v TFA的流动相。11.权利要求7的方法,其中使用包含约20% v/v至约50% v/v乙腈的流动相从反相吸附剂中洗脱可溶性tau。12.权利要求11的方法,其中使用包含约20% v/v至约40% v/v乙腈或约30% v/v至约50% v/v乙腈的流动相从反相吸附剂中洗脱可溶性tau。13.前述权利要求中任一项的方法,其中tau的N末端内的表位包含氨基酸残基27
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35,并且其中tau的中间结构域内的表位包含氨基酸残基192
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199。14.前述权利要求中任一项的方法,其中亲和纯化使用至少一种特异性结合在tau的N末端内的表位的表位结合剂和至少一种在tau的中间结构域内特异性结合的表位结合剂。15.权利要求13或权利要求14的方法,其中每种表位结合剂是抗体。16.一种用于处理血液样品以富集可溶性tau的方法,所述方法包括:使用高氯酸从血液样品中沉淀蛋白质,其中将高氯酸添加到约1% v/v至约15% v/v的最终浓度,从而产生血液的酸溶性提取物;和通过固相萃取和亲和纯化浓缩酸溶性提取物中的可溶性tau,其中:固相萃取步骤包括(i)将酸溶性提取物与反相吸附剂混合足以使可溶性tau粘附到反相吸附剂上的时间,其中反相吸附剂是包含N
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乙烯基吡咯烷酮和二乙烯基苯的聚合物或包含苯乙烯和二乙烯基苯的聚合物,(ii)用包含约0.05% v/v至约1% v/v TFA的流动相洗涤粘附到反相吸附剂上的tau,和(iii)使用包含约0.05% v/v至约1% v/v TFA和约20% v/v至约50% v/v乙腈的流动相从反相吸附剂中洗脱可溶性tau;以及亲和纯化步骤包括至少一种特异性结合在tau的N末端内的表位的表位结合剂和至少一种特异性结合在tau的中间结构域内的表位的表位结合剂。
17.权利要求16的方法,其中流动相包含约0.05% v/v至约0.5% v/v TFA。18.权利要求16的方法,其中流动相包含约0.1% v/v TFA至约1% v/v TFA。19.权利要求17或权利要求18的方法,其中用于洗脱tau的流动相包含约20% v/v至约40% v/v的乙腈。20.权利要求17或权利要求18的方法,其中用于洗脱tau的流动相包含约30% v/v至约50% v/v的乙腈。21.权利要求16至20中任一项的方法,其中tau的N末端内的表位包含氨基酸残基27
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35,并且其中tau的中间结构域内的表位包含氨基酸残基192
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199。22.权利要求16至21中任一项的方法,其中每种表位结合剂是抗体。23.一种用于分析血液样品中的可溶性tau的方法,所述方法包括根据权利要求1至22中的任一项处理血液样品,以产生富含可溶性tau的样品;和通过质谱法分析富含可溶性tau的样品。24.一种用于确定血液样品中的总tau量的方法,所述方法包括:根据权利要求1至22中的任一项处理血液样品,以产生富含可溶性tau的样品;和通过质谱法分析富含可溶性tau的样品。25.一种用于测量tau的一个或多个残基处的磷酸化量的方法,所述方法包括:根据权利要求1至22中的任一项处理血液样品,以产生富含可溶性tau的样品;和通过质谱法测量tau的一个或多个残基处的磷酸化量。26.权利要求25的方法,其中在选自T111、S113、T181、S199、S202、S208、T153、T175、T205、S214、T217和T231的一个或多个残基处测量tau的磷酸化。27.权利要求25的方法,其中在包括T181、S202或T217中的至少一个的一个或多个残基处测量tau的磷酸化。28.权利要求25的方法,其中在包括T181、S202或T217中的至少一个的两个或更多个残基处测量tau的磷酸化。29.权利要求23至28中任一项的方法,其中血液样品是至少约1 ml的血浆或至少约2 ml的全血。30.权利要求23至28中任一项的方法,其中血液样品是至少约1 ml至约20 ml的血浆。31.权利要求23至30中任一项的方法,所述方法进一步包括在胰蛋白酶、Lys
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N、Lys
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C或Arg
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N存在下进行的消化步骤,其中所述消化步骤发生在处理血液样品之后。32.权利要求23至30中任一项的方法,所述方法进一步包括在胰蛋白酶、Lys
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N、Lys
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C或Arg
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N存在下进行的消化步骤,其中所述消化步骤在tau与至少一种表位结合剂结合时发生。33.权利要求31或32的方法,其中所述消化步骤在胰蛋白酶存在下发生。34.前述权利要求中任一项的方法,其中所述血液样品获自无症状受试者,表现出阿尔茨海默氏病的体征或症状但未表现出足够的认知或功能损害用于临床诊断由阿尔茨海默氏病引起的轻度认知损害的受试者,被诊断为患有AD的受试者,被诊断为患有神经退行性疾病的受试者,被诊断为患有tau蛋白病的受试者,被诊断为患有痴呆的受试者,或被诊断为患有轻度认知损害的受试者。35.权利要求34的方法,其中所述血液样品获自被诊断为患有进行性核上性麻痹
(PSP)、皮质基底节综合征(CBS)、唐氏综合征(DS)、帕金森病(PD)和路易体痴呆(DLB)的受试者。36.一种在阿尔茨海默氏病发作之前诊断受试者的方法,所述方法包括:(a)提供从受试者获得的分离的tau样品,其中所述分离的tau样品是通过权利要求1至35中任一项的方法产生的;并且测量在(i) T217和T205处、(ii) T181和T205处或(iii)T181、T205和T217处的tau磷酸化;(b)当T217或T181处的tau磷酸化为约1.5σ或更高且T205处的tau磷酸化为约1.5σ或更低时,将受试者诊断为由于阿尔茨海默氏病而转化为轻度认知损害的风险增加,其中σ是由在如通过PET成像和/或CSF中的Aβ42/40测量所测量的不具有脑淀粉样蛋白斑块的对照群体中所测量的在T217和T205处、T181和T205处或T181、T205和T217处的tau磷酸化的正态分布所定义的标准偏差。37.一种在阿尔茨海默氏病发作之前诊断受试者的方法,所述方法包括:(a) 提供从所述受试者获得的分离的tau样品,其中所述分离的tau样品是通过权利要求1至35中任一项的方法产生的;并且测量总tau并测量在(i)T217和T205处、(ii)T181和T205处或(iii)T181、T205和T217处的tau磷酸化;和(b) 当T217或T181处的tau磷酸化与总tau的比率高于2σ并且T205处的tau磷酸化与总tau的比率低于2σ时,将所述受试者诊断为由于阿尔茨海默氏病而转化为轻度认知损害的风险增加,其中σ是由在如通过PET成像和/或CSF中的Aβ42/40测量所测量的不具有脑淀粉样蛋白斑块的对照群体中所测量的总tau以及在T217和T205处、T181和T205处或T181、T205和T217处的tau磷酸化的正态分布所定义的标准偏差。38.一种在阿尔茨海默氏病发作之前诊断受试者的方法,所述方法包括:(a) 提供从所述受试者获得的分离的tau样品,其中所述分离的tau样品是通过权利要求1至35中任一项的方法产生的;并且测量在(i)T217和T205处、(ii)T181和T205处或(iii)T181、T205和T217处的tau磷酸化;和(b) 当在(i)T217和T205处、(ii)T181和T205处或(iii)T181、T205和T217处的tau磷酸化为约1.5σ或更高时,将所述受试者诊断为由于阿尔茨海默氏病而转化为轻度认知损害的风险增加,其中σ是由在如通过PET成像和/或CSF中的Aβ42/40测量所测量的不具有脑淀粉样蛋白斑块的对照群体中所测量的T217和T205处、T181和T205处或T181、T205和T217处的tau磷酸化的正态分布所定义的标准偏差。39.一种在阿尔茨海默氏病发作之前诊断受试者的方法,所述方法包括:(a) 提供从所述受试者获得的分离的tau样品,其中所述分离的tau样品是通过权利要求1至35中任一项的方法产生的;并且测量总tau并测量在(i)T217和T205处...
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