用于磷酸化的化合物的固相萃取的螯合剂基洗脱液制造技术

本技术涉及一种用于提高磷酸化的化合物(例如，磷酸化的聚糖)的回收率的方法。特别地，本技术利用含某些螯合剂添加剂的溶液从固相萃取柱洗涤和洗脱磷酸化的化合物。萃取柱洗涤和洗脱磷酸化的化合物。萃取柱洗涤和洗脱磷酸化的化合物。

Chelator based eluent for solid phase extraction of phosphorylated compounds

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于磷酸化的化合物的固相萃取的螯合剂基洗脱液
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2019年12月5日提交的美国临时申请序列号62/944,153的权益，该申请的全部内容以引用方式并入本文。


[0003]本公开涉及螯合剂添加剂用于提高化合物，并且特别是磷酸化的聚糖的固相萃取回收率的用途。更具体地，本公开涉及螯合剂添加剂的用途，这些螯合剂添加剂既可溶于水溶液中又可溶于乙腈溶液中，并在洗脱步骤中使用以在固相萃取(SPE)期间获得高收率和无偏差回收率的磷酸化的化合物，包括各种聚糖物质。

技术介绍

[0004]从样品基质中萃取寡糖是许多不同类型分析中的重要步骤。在一个示例中，通过化学或酶法释放连接到蛋白质的寡糖，并且使用液相色谱法剖析所得的所谓的“聚糖”。然而，通常需要在分析之前衍生化所释放的聚糖，以便它们可以通过UV、荧光或质谱进行检测。
[0005]对于这种类型的分析，通常需要通过固相萃取(SPE)萃取寡糖以最大限度地减少对衍生化反应或色谱分离的干扰。使用GlycoWorks RapiFluor
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MS试剂盒(可从Waters Corporation,Milford,MA商购获得)的常用衍生化方法在反应副产物的基质中产生衍生化的N
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聚糖样品，这些反应副产物可以使多种形式的色谱法复杂化，包括亲水性相互作用色谱法(HILIC)和反相(RPLC)分离法。因此，采用SPE富集寡糖并提高测定质量。
[0006]历史上，回收和分析磷酸化的聚糖物质一直是一项重要的挑战。这是成问题的，因为一些特定类型的蛋白质，如许多负责溶酶体功能的酶，是用甘露糖
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磷酸转译后修饰的。实际上，当用作酶替代疗法时，甘露糖
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磷酸对溶酶体酶的摄取至关重要。
[0007]开发SPE试剂盒、洗脱溶液和能够产生高收率以及无偏差回收率的各种聚糖物质的方法将是有利的。另外，开发一种用于萃取寡糖的SPE程序将是有利的，该SPE程序最大限度地减少对衍生化反应或后续色谱分离的干扰。开发SPE试剂盒、洗脱溶液和用于萃取其他磷酸化的化合物(包括但不限于寡核苷酸、磷酸化的肽、磷酸化的蛋白质、草甘膦/草甘膦相关物质、双膦酸盐药物和磷脂)的方法也将是有利的。

技术实现思路

[0008]本技术提供了一种具有选定的螯合剂添加剂的优化的SPE洗脱溶液以最大限度地减少固相萃取期间磷酸化的聚糖的损失。不希望受理论束缚，据信螯合剂添加剂起破坏磷酸聚糖对SPE装置中金属污染物的吸附的作用。磷酸基团表现出对金属螯合的天然倾向。虽然不限于这项理论，但螯合剂在破坏路易斯酸/碱与吸附剂杂原子的相互作用中也可能发挥作用。GlycoWorks(可购自Waters Corporation)HILIC SPE基于氨丙基键合的二氧化硅吸附剂。吸附剂的氮原子可能产生路易斯酸
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碱相互作用的位点，该位点只能通过引入强螯
合剂来置换。无论作用机理如何，使用螯合剂基洗脱液的本技术是一种提高磷酸化的聚糖的SPE回收率的有效手段。
[0009]在一些实施方案中，选择螯合剂添加剂是因为其溶解度性质。例如，在其中期望在SPE分离后执行HILIC的实施方案中，使用可溶于乙腈中的螯合剂添加剂是有利的。某些螯合剂诸如依替膦酸盐从高浓度乙腈溶液中沉淀析出。这些沉淀物会造成堵塞或干扰后续HILIC分离/设备。在其中在继SPE之后要执行RPLC的其他实施方案中，可溶于水溶液中的螯合剂是期望的。浓度介于约1mM至约200mM之间的二价或更高价羧酸既可溶于水溶液中又可溶于高百分比的乙腈中。可用于本技术中的三价羧酸的示例是柠檬酸(固体形式为柠檬酸盐，诸如柠檬酸钠)。本技术中有效用的附加的示例性三价酸包括异柠檬酸、2,3羟基柠檬酸、丙三羧酸、乙烷三羧酸(HETA)和乌头酸。也可以利用其他二价或更高价羧酸。合理地认为琥珀酸、马来酸、富马酸、草酰乙酸和酮戊二酸在本技术中有一些效用。四价羧酸，如EDTA(乙二胺四乙酸)、丁烷四羧酸、NTA、DTPA、DOTA、IDHA、EDDHA也可能有一些效用。在另选的实施方案中，丁二酮肟和二乙烯三胺也可能用于本技术中。一般而言，洗脱溶液内二价或更高价羧酸的浓度应为约1M或小于1M，并且优选地小于约200mM(例如，介于约0.5mM至200mM之间)。在一些实施方案中，浓度为约100mM或小于100mM，并且在约1mM至100mM的范围内。在某些实施方案中，浓度在介于10mM和100mM之间的范围内。在其他实施方案中，浓度在介于40mM和60mM之间的范围内，诸如例如约50mM。
[0010]在一个方面，本技术涉及一种执行固相萃取的方法。该方法包括将包含聚糖的样品进样到固相萃取柱中。SPE柱包含固定相，其中聚糖被固定相保留。该方法还包括用浓度介于约1mM至约100mM之间的二价或更高价羧酸洗涤SPE柱以从SPE柱洗脱聚糖。
[0011]在另一方面，本技术涉及一种执行固相萃取的方法。该方法包括将包含聚糖的样品进样到固相萃取柱中。SPE柱包含固定相，其中聚糖被固定相保留。该方法还包括用浓度介于约1mM至约100mM之间的柠檬酸洗涤SPE柱以从SPE柱洗脱聚糖。在一个实施方案中，浓度介于约40mM和60mM之间(例如，45mM、50mM、55mM)以从SPE柱洗脱聚糖。
[0012]根据另一方面，本技术涉及一种执行固相萃取的方法。该方法包括将包含聚糖的样品进样到包含固定相的固相萃取柱中，其中聚糖被固定相保留。该方法还包括用洗脱溶液洗涤固相萃取柱以从固相萃取柱洗脱聚糖，其中洗脱溶液包含(i)用以调节洗脱溶液的离子强度的盐和(ii)浓度介于约1mM至约100mM之间的二价或更高价羧酸。
[0013]本技术的这方面的一些实施方案包括以下特征中的一个或多个特征。在一些实施方案中，盐选自由以下组成的组：甲酸铵、乙酸铵、甲酸钠、乙酸钠、氯化铵、氯化钠、氯化钾、三乙基乙酸铵和四甲基乙酸铵。在某些实施方案中，洗脱溶液用共溶剂制备，该共溶剂选自由以下组成的组：乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、四氢呋喃、异丙醇。
[0014]根据另一方面，本技术涉及一种执行固相萃取的方法。该方法包括将包含聚糖的样品进样到包含固定相的固相萃取柱中，其中聚糖被固定相保留。该方法还包括用洗脱溶液洗涤固相萃取柱以从固相萃取柱洗脱聚糖，其中洗脱溶液包含(i)用以调节洗脱溶液的离子强度的盐和(ii)浓度介于约1mM至约100mM之间的柠檬酸。在某些实施方案中，柠檬酸的浓度介于约40mM和约60mM之间。
[0015]本技术的这方面的一些实施方案包括以下特征中的一个或多个特征。在一些实施方案中，盐选自由以下组成的组：甲酸铵、乙酸铵、甲酸钠、乙酸钠、氯化铵、氯化钠、氯化钾、
三乙基乙酸铵和四甲基乙酸铵。在某些实施方案中，洗脱溶液用共溶剂制备，该共溶剂选自由以下组成的组：乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、四氢呋喃、异丙醇。
[0016]在另一方面，本技术涉及一种执行固相本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种执行固相萃取的方法，所述方法包括：将包含聚糖的样品进样到包含固定相的固相萃取柱中，其中所述聚糖被所述固定相保留；以及用浓度介于约1mM至约100mM之间的二价或更高价羧酸洗涤所述固相萃取柱以从所述固相萃取柱洗脱所述聚糖。2.一种执行固相萃取的方法，所述方法包括：将包含聚糖的样品进样到包含固定相的固相萃取柱中，其中所述聚糖被所述固定相保留；以及用浓度介于约1mM至约100mM之间的柠檬酸洗涤所述固相萃取柱以从所述固相萃取柱洗脱所述聚糖。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述浓度介于约40mM和60mM之间，以从所述固相萃取柱洗脱所述聚糖。4.一种执行固相萃取的方法，所述方法包括：将包含聚糖的样品进样到包含固定相的固相萃取柱中，其中所述聚糖被所述固定相保留；以及用洗脱溶液洗涤所述固相萃取柱以从所述固相萃取柱洗脱所述聚糖，其中所述洗脱溶液包含(i)用以调节所述洗脱溶液的离子强度的盐和(ii)浓度介于约1mM至约100mM之间的二价或更高价羧酸。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述盐选自由以下组成的组：甲酸铵、乙酸铵、甲酸钠、乙酸钠、氯化铵、氯化钠、氯化钾、三乙基乙酸铵和四甲基乙酸铵。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述溶液用共溶剂制备，所述共溶剂选自由以下组成的组：乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、四氢呋喃、异丙醇。7.一种执行固相萃取的方法，所述方法包括：将包含聚糖的样品进样到包含固定相的固相萃取柱中，其中所述聚糖被所述固定相保留；以及用洗脱溶液洗涤所述固相萃取柱以从所述固相萃取柱洗脱所述聚糖，其中所述洗脱溶液包含(i)用以调节所述洗脱溶液的离子强度的盐和(ii)浓度介于约1mM至约100mM之间的柠檬酸。8.根据权利要求7所述的方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘潇潇，M，
申请(专利权)人：沃特世科技公司，
类型：发明
国别省市：