一种鸡TIPE1基因多克隆抗体的制备方法与应用技术

本发明专利技术适用于生物应用技术领域，提供了一种鸡TIPE1基因多克隆抗体的制备方法，利用鸡TIPE1基因的全长核苷酸序列进行PCR扩增，后利用同源重组技术构建重组表达质粒，经IPTG诱导表达出可溶性重组TIPE1蛋白并进行纯化，随后将蛋白免疫兔子获得抗TIPE1血清。本发明专利技术设计方法操作简便，费用成本低，制备出的可溶性蛋白大大缩短了后续纯化的时间，且免疫效果好、抗体效价高。本发明专利技术弥补了鸡TIPE1抗体制备及研究的空白，为蛋鸡脂肪肝出血综合征等畜禽代谢性疾病的研究提供了新的思路，具有广泛的推广意义。广意义。广意义。

Preparation and application of a polyclonal antibody against chicken tipe1 gene

【技术实现步骤摘要】
一种鸡TIPE1基因多克隆抗体的制备方法与应用


[0001]本专利技术属于生物应用
，尤其涉及一种鸡TIPE1基因多克隆抗体的制备方法与应用。

技术介绍

[0002]脂肪肝出血综合征（Fatty liver hemorrhagic syndrome，FLHS）是一种以肝脏和腹腔脂肪积累过多为特征的非传染性疾病，可导致肝脏破裂、出血和猝死。它是世界上最常见的导致蛋鸡死亡的非传染性疾病，严重影响蛋鸡产蛋率，给蛋鸡养殖业造成巨大损失。FLHS多发生于笼养型产蛋鸡，与营养、环境以及遗传等多种因素有关，因鸡只死亡和产蛋下降，造成严重的经济损失。
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在流行病学调查中显示，国内不低于40%的笼养产蛋鸡死亡与FLHS有关，在很多鸡场，FLHS是蛋鸡死淘的主要原因。此外，FLHS与炎症、自噬和凋亡等许多生理过程密切相关。肝脂积累和损伤与肝脏炎症有关，肝脏炎症可导致肝出血，进而诱发FLHS。此外，FLHS可以激活炎症通路或导致肝脏自噬和凋亡的紊乱，进而诱发FLHS。
[0003]肿瘤坏死因子
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α诱导蛋白8（Tumor necrosis factor
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α
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induced protein 8 like 1，TIPE1）是肿瘤坏死因子
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α
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诱导蛋白8（Tumor necrosis factor
‑
α
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induced protein 8, TNFAIP8）家族成员之一，已被证实在细胞增殖、凋亡和免疫系统疾病等过程中发挥重要作用。其中，TIPE1对自噬、凋亡和脂质代谢均有显著影响。TIPE1可以通过抑制p53活性或抑制自噬来促进肿瘤的增殖和进展。此外，TIPE家族成员可与PIP2、PIP3、PIP4、PA等脂质分子特异性结合，从而参与脂质和磷信号的调控。TIPE1通过抑制ASK1的多泛素化，抑制肝脏脂肪变性、炎症和纤维化。因此，根据以往的研究，对TIPE1在各种生理过程中的变化的研究一直是近期研究的重点，TIPE1确实在自噬、免疫、脂质代谢等方面发挥着重要作用。尽管目前的研究发现TIPE1确实参与了脂质代谢的调节，但TIPE1与FLHS的关系尚不清楚，对于鸡TIPE1抗体的研究也尚属空白。

技术实现思路

[0004]本专利技术实施例的目的在于提供一种鸡TIPE1基因多克隆抗体的制备方法与应用，旨在解决尽管目前的研究发现TIPE1确实参与了脂质代谢的调节，但TIPE1与FLHS的关系尚不清楚，对于鸡TIPE1抗体的研究也尚属空白的问题。
[0005]本专利技术实施例是这样实现的，一种鸡TIPE1基因多克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：以鸡的cDNA为模板，对TIPE1基因进行PCR扩增反应，得到目的片段，用于PCR扩增的引物核苷酸序列为：F
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：GCCATGGCTGATATCGGATCCATGGACACCTTCAGCACCAAR
’
：GCGGCCGCAAGCTTGTCGACAGTATACAACAGGAGGAGGTCG步骤2：利用步骤1中的目的片段与大肠杆菌表达载体pET
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32a(+)应用同源重组的方式进行连接反应，得到重组表达质粒pET
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32a
‑
TIPE1；
步骤3：将上述步骤2中的重组表达质粒pET
‑
32a
‑
TIPE1先转入Trelief
TM 5α克隆感受态细胞，再转入BL21(DE3)表达感受态细胞，得到阳性菌落；步骤4：将上述步骤3中阳性菌落进行培养，将培养后的菌液利用IPTG进行诱导表达（条件：IPTG浓度为0.3 mM ，18℃，18 h，150 rpm/min），经镍柱（Ni
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TED）纯化后获得鸡TIPE1重组蛋白（咪唑洗脱浓度：200 mM）；步骤5：利用上述步骤4中鸡TIPE1重组蛋白（浓度：0.667 mg/mL），对兔子进行免疫（皮内注射），免疫次数为3次，每次免疫前对兔子进行采血，最后一次免疫后12天对兔子进行采血，分离血清得到所述鸡TIPE1基因多克隆抗体；步骤6：利用酶联免疫吸附试验（ELISA）、蛋白免疫印记试验（Western Blot）、免疫组化技术（Immunohistochemical，IHC）和免疫荧光技术（Immunofluorescence，IF）对所述鸡TIPE1基因多克隆抗体进行抗体质量验证。
[0006]进一步的技术方案， ELISA试验中：抗原包被的最佳稀释浓度为1.25 μg/mL；抗TIPE1血清和免疫前血清的稀释梯度为：1:100～1:819200；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG稀释浓度为1:5000；酶标仪的反应波长为450 nm。
[0007]进一步的技术方案，WB试验中抗TIPE1血清和免疫前血清的稀释比例为1:1000；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG的稀释比例为1:5000。
[0008]进一步的技术方案，IHC和IF试验中抗TIPE1血清和免疫前血清的稀释比例为1:500；CY3标记山羊抗兔IgG的稀释比例为1：1000。
[0009]进一步的技术方案，所述步骤1中的PCR扩增反应条件为：预变性：94℃，2 min；变性：94℃，30 s；退火：54℃，30 s；延伸1：72℃，1 min；从变性到延伸1共35个循环；延伸2：72℃，5 min。
[0010]本专利技术实施例的另一目的在于，一种鸡TIPE1基因多克隆抗体在制备蛋鸡脂肪肝出血综合征疾病检测工具中的应用，所述的鸡TIPE1基因多克隆抗体是由权利要求1
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5所述的制备方法制得的。
[0011]进一步的技术方案，所述检测工具为试剂或试剂盒。
[0012]本专利技术实施例提供的一种鸡TIPE1基因多克隆抗体的制备方法与应用，通过利用鸡TIPE1基因的全长核苷酸序列进行PCR扩增，后利用同源重组技术构建重组表达质粒，经IPTG诱导表达出可溶性重组TIPE1蛋白并进行纯化，随后将蛋白免疫兔子获得抗TIPE1血清。本专利技术设计方法操作简便，费用成本低，制备出的可溶性蛋白大大缩短了后续纯化的时间，且免疫效果好、抗体效价高。本专利技术弥补了鸡TIPE1抗体制备及研究的空白，为蛋鸡脂肪肝出血综合征等畜禽代谢性疾病的研究提供了新的思路，具有广泛的推广意义。
附图说明
[0013]图1为鸡TIPE1基因多克隆抗体研制方法及其在蛋鸡脂肪肝出血综合征中应用的主要流程图；图2为克隆表达重组质粒pET
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32a
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TIPE1的构建；图3为重组TIPE1蛋白的表达与纯化；图4为ELISA法测定抗TIPE1血清效价；图5为荧光定量PCR法和免疫印迹法检测不同年龄段海兰褐蛋鸡在不同组织中的
表达丰度；图6为免疫荧光法检测海兰褐蛋鸡相关组织（肝、十二指肠、盲肠）TIPE1蛋白表达；图7为荧光定量本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鸡TIPE1基因多克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：以鸡的cDNA为模板，对TIPE1基因进行PCR扩增反应，得到目的片段，用于PCR扩增的引物核苷酸序列为：F
’
：GCCATGGCTGATATCGGATCCATGGACACCTTCAGCACCAAR
’
：GCGGCCGCAAGCTTGTCGACAGTATACAACAGGAGGAGGTCG步骤2：利用步骤1中的目的片段与大肠杆菌表达载体pET
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32a(+)应用同源重组的方式进行连接反应，得到重组表达质粒pET
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TIPE1；步骤3：将上述步骤2中的重组表达质粒pET
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32a
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TIPE1先转入Trelief
TM 5α克隆感受态细胞，再转入BL21(DE3)表达感受态细胞，得到阳性菌落；步骤4：将上述步骤3中阳性菌落进行培养，将培养后的菌液利用IPTG进行诱导表达，经镍柱纯化后获得鸡TIPE1重组蛋白；步骤5：利用上述步骤4中鸡TIPE1重组蛋白，对兔子进行免疫，免疫次数为3次，每次免疫前对兔子进行采血，最后一次免疫后12天对兔子进行采血，分离血清得到所述鸡TIPE1基因多克隆抗体；步骤6：利用酶联免疫吸附试验、蛋白免疫印记试验、免疫组化技术和免疫荧光技术对所述鸡TIPE1基因多克隆抗体进行抗体质量验证。2.根据权利要求1所述的鸡TIPE1基因多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤1中的PCR扩增反应条件为：预变性：94℃，2min；变性：94℃，30s；退火：54℃，30s；...

【专利技术属性】
技术研发人员：程鑫怡，庄煜，胡国良，
申请(专利权)人：江西农业大学，
类型：发明
国别省市：