一种用于筛选痛经模型小鼠生物标志物的肝脏代谢组学方法技术

本发明专利技术公开了一种用于筛选痛经模型小鼠生物标志物的肝脏代谢组学方法，涉及中医药研究领域。本发明专利技术采用代谢组学方法分析雌二醇诱导的痛经小鼠，空白对照组以及中药当归

【技术实现步骤摘要】
一种用于筛选痛经模型小鼠生物标志物的肝脏代谢组学方法


[0001]本专利技术涉及中医药研究领域，具体涉及一种用于筛选痛经模型小鼠生物标志物的肝脏代谢组学方法。

技术介绍

[0002]痛经是所有女性不分年龄和种族一种常见的妇科疾病，当对痛经患病率的研究进行检查时，报告的发病率在45.3％和90％之间。这严重影响着育龄妇女的学习、工作和生活，患有痛经的妇女普遍易怒，全球女性中，总会有因痛经而缺勤一天甚至多天的。临床上认为，痛经是子宫平滑肌过度收缩造成子宫供血不足而引起的，伴随有腹部绞痛，更甚者可能会出现腰痛、头痛和胃肠道症状。痛经随着经期呈现周期性复发，并且没有任何可识别的生殖系统病理变化。虽然非甾体类抗炎药(NSAIDs)是目前治疗痛经的一线药物，疗效确切，但无效率可达20
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30％。因此，亟需寻找无副作用且更有效的治疗药物。
[0003]中医学认为痛经病在冲任、胞宫，主要病因病机为情志抑郁，冒寒饮冷等导致气血运行不畅，气机阻滞，不通则痛或素体气血亏虚，胞宫失养，不荣则痛。痛经为病，以止痛治疗为治标，未痛调理是治本，因而祛瘀莫贵于行气，行气莫贵于疏肝。中医理论认为肝脏功能的正常与否对女性妇科疾病的发生起着主导作用，尤其是肝主疏泄对原发性痛经的治疗具有重要指导意义。如《医碥》所言：“郁则不舒，则皆肝木之病矣”。从以上理论分析，经血是否正常，有赖肝主疏泄功能是否正常。“当归
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益母草”最初源自《竹林寺女科密方》记载的益母丸，为治疗妇科疾病的传统古方，具有治疗气滞血瘀的作用。益母草为君药，当归为臣药，药理研究显示，益母草具有抗心肌缺血、抗血栓以及调节子宫平滑肌等作用，当归具有调节子宫平滑肌，增强免疫，抗心律失常，抗血小板聚集等作用，二者配伍使用，具有治疗气滞血瘀型证候的功效。
[0004]代谢组学是对生物样本(例如细胞、体液、组织、呼出的空气、植物)中代谢物的综合分析，在疾病诊断、药物研发、生物学功能研究等领域应用广泛。通过代谢组学结合模式识别分析揭示中药的疗效具有深远的意义。
[0005]但是目前为止尚未有使用代谢组学方法研究当归
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益母草治疗痛经作用的报道，因此需开发一种基于肝脏代谢组学的痛经治疗作用机制研究方法。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种用于筛选痛经模型小鼠生物标志物的肝脏代谢组学方法，对样本进行代谢组学数据分析，寻找具有治疗痛经的作用(P<0.05)的特异性生物标记物。
[0007]本专利技术所采取的技术方案是：采用1H NMR技术检测肝脏样本，分析数据。具体包括以下步骤：(1)实验分组：将小鼠分为以雌二醇模型组，空白对照组，中药当归
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益母草治疗组；
(2)收集小鼠的血清与肝脏样本，血液样本用于ELISA分析，肝脏样本用于代谢组学分析；(3)样品的前处理与1H NMR检测；(4)数据处理，比较空白对照组与模型组，筛选出痛经模型生物标记物，与中药当归
ꢀ‑
益母草治疗组对比筛选出具有抗痛经作用机制的特异性生物标记物；(5)通过MetaboAnalyst在线分析软件对上述步骤获得的特异性生物标记物进行通路分析。
[0008]进一步的，步骤(1)动物处理及样品收集的的具体方法为：将15只KM种小鼠随机分为2组，对照组(n＝5)和模型组(n＝10)。口服苯甲酸雌二醇引起小鼠痛经。模型组小鼠连续10天口服苯甲酸雌二醇CMC混悬液(2mg/kg/d)，对照组小鼠口服等体积生理盐水。第10天，雌二醇处理小鼠分为2组(每组5只)，模型组、中药当归
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益母草治疗组(Drug，剂量为12.0g/kg)。中药当归
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益母草治疗组小鼠每天给予当归
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益母草提取物水溶液，模型组和对照组小鼠连续6天给予相同体积的生理盐水。在第16天结束时，所有小鼠都被禁食过夜。第17天，每组小鼠在末次给药后1小时腹腔注射催产素(20U/kg)，记录注射后 30min内小鼠的扭体反应次数。第17天给药结束时，通过腹主动脉取血至真空管，颈椎脱臼处死小鼠，75％乙醇擦拭皮肤后剪开腹腔，通过剪切肝脏组织后得到的样本。
[0009]进一步的，步骤(2)所述的样品的前处理方法如下：将小鼠血清样本以3000～3500 转/分钟离心10分钟，取上清液用于酶标仪检测；肝脏样本在50％乙腈水溶液(5mL/g组织) 中匀浆2～3次，并将混合物超声10min使其混合均匀，接下来在4℃和12,000rpm下离心10min。将上清液在氮气下吹干。将干燥后组织提取物溶解在550μL含0.01％TSP的 D2O中，并转移到核磁管中进行NMR分析。
[0010]进一步的，所述的1H NMR检测分析条件为：采用Bruker AV III HD 400MHz型谱仪(频率为400MHz)，实验温度297K。测试前需要对仪器进行温度校正，匀场校正。采用NOESY脉冲序列进行分析。90
°
脉冲长度为10μs，混合时间tm 100ms，谱宽20ppm，驰豫时间2s，信号累加次数(NS)为64，采样点数(TD)为65536。在傅立叶变换之前，使用具有0.3Hz的线展宽的指数窗函数对FID进行加权。
[0011]进一步的，所述痛经模型生物标记物具体如下所示：
备注：C为空白对照组，M为模型组，Drug为中药当归
‑
益母草治疗组。
↑
表示信号的相对增加；
↓
表示信号的相对减少。*和**分别代表统计学差异P<0.05、P<0.01。
[0012]进一步的，步骤(5)所述的通路分析还包括将23个生物标记物导入 MetaboAnalyst、KEGG数据库构建分析疾病相关代谢通路，得到相关的代谢路径；当归
‑ꢀ
益母草干预痛经的关键通路主要与能量代谢、甘油酯代谢、脂肪酸代谢、氨基酸代谢等通路相关。
[0013]本专利技术的有益效果是：
[0014]本专利技术基于1H NMR技术代谢组学的研究方法，对痛经小鼠肝脏代谢物进行检测，通过代谢组学研究方法寻找差异代谢物，通过筛选排除机制，获得23种具有治疗痛经作用机制的生物标记物，利用生物标记物含量的回调变化来实现对痛经作用机制的识别及高通量分析；通过MetaboAnalyst在线分析软件对差异代谢物进行通路分析，可从整体水平综合评价当归
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益母草抗痛经的作用机制，为中药的代谢组学及作用机制的阐明提供示范性研究。
附图说明：
[0015]图1是当归
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益母草对小鼠靶点TNF
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α、IL6、PTGS2和VEGF水平的影响柱形图，C为对照组，M表示模型组，Drug表示中药当归
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益母草治疗组，*、**分别表示各组与模型组有显著差异(p<0.05)、极显著差异(p<0.01)。
[0016]图2是本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于筛选痛经模型小鼠生物标志物的肝脏代谢组学方法，包括以下步骤：(1)实验分组：将小鼠分为以雌二醇和催产素诱导的痛经模型组，等量生理盐水喂养的空白对照组，灌胃给药的中药当归
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益母草治疗组；(2)观察最后一天注射催产素后小鼠的扭体反应，收集小鼠的血清与肝脏样本，血液样本用于ELISA分析，肝脏样本用于代谢组学分析；样品的前处理与1H NMR检测；(3)数据处理，比较空白对照组与模型组代谢物，筛选出痛经模型生物标记物，与中药当归
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益母草治疗组对比筛选出具有治疗痛经作用机制的生物标记物；(4)通过MctaboAnalyst在线分析软件对上述步骤获得的特异性生物标记物进行通路分析。2.根据权利要求1所述的一种用于筛选痛经模型小鼠生物标志物的肝脏代谢组学方法，其特征在于，所述的中药当归
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益母草治疗组所用的药物为当归
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益母草水提取物，包括当归和益母草两种药材，其比例为3:2，水提取物每ml含有1.5g生药，每天给药量为12g/kg。3.根据权利要求1所述的一种用于筛选痛经模型小鼠生物标志物的肝脏代谢组学方法，其特征在于，步骤2)所述的小鼠血清样本是取自第17天通过腹主动脉取血至真空管，离心取上清液，最后颈椎脱臼处死小鼠，75％乙醇擦拭皮肤后剪开腹腔，通过剪切肝脏组织后得到的样本。4.根据权利要求1所述的一种用于筛选痛经模型小鼠生物标志物的肝脏代谢组学方法，其特征在于，步骤2)所述的样品的前处理方法如下：将小鼠血清样本以3000～3500转/分钟离心10分钟，取上清液用于酶标仪进行检测；将肝脏样本在50％乙腈水溶液(5mL/g组织)中匀浆2～3次，并将混合物超声10min使其混合均匀，接下来在4℃和12,000rpm下离心10min。将上清液在氮气下吹干。将干燥后组织提取物溶解在550μL含0.01％TSP的D2O中，并转移到核磁管中进行NMR分析。5.根据权利要求1所述的一种用于筛选痛经模型小鼠生物标志物的肝脏代谢组学方法，其特征在于，所述的1H NMR检测分析条件为：采用Bruker AV III HD 400M...

【专利技术属性】
技术研发人员：熊艳，曹旭媛，徐锋，吴学文，李维，罗振峰，
申请(专利权)人：湘潭大学，
类型：发明
国别省市：