一种荧光偏振检测幽门螺旋杆菌的方法技术

本发明专利技术公开了一种荧光偏振检测幽门螺旋杆菌的方法，基于金纳米粒子和幽门螺旋杆菌适配体的纳米球，主要包括以下步骤：S1:金纳米粒子的制备；S2:纳米球的组装；S3:幽门螺旋杆菌的检测；S4:对含幽门螺旋杆菌的实际样品进行定量检测。本发明专利技术具有优异的幽门螺旋杆菌检测效果，动态响应范围在0.9CFU/mL至0.9

A fluorescence polarization method for detection of Helicobacter pylori

【技术实现步骤摘要】
一种荧光偏振检测幽门螺旋杆菌的方法


[0001]本专利技术涉及检测幽门螺旋杆菌的
，更具体的是涉及一种荧光偏振检测幽门螺旋杆菌的方法。

技术介绍

[0002]幽门螺杆菌是一种螺旋形、微厌氧、对生长条件要求十分苛刻的细菌。1983年首次从慢性活动性胃炎患者的胃黏膜活检组织中分离成功，是目前所知能够在人胃中生存的唯一微生物种类。世界有多半人口受到过幽门螺杆菌的感染，而在有些国家几乎90％的人都感染过这种细菌。人们通常是在幼年时就受到感染，5岁以下达到50％。这种细菌感染首先引起慢性胃炎，并导致胃溃疡和胃萎缩，严重者则发展为胃癌。
[0003]幽门螺杆菌的检测方法可以分为侵入性和非侵入性方法。侵入性检测包括：快速尿素酶试验、胃黏膜组织切片染色镜检、细菌培养；非侵入性检测包括：13C或14C呼气试验、血清Hp抗体、粪便Hp抗原检测。其他的一些检测方法还有表面等离子体共振(SPR)、酶联免疫法(ELISA)、聚合酶链反应法(PCR)、滚环扩增(Rolling circle amplification，RCA)、流式细胞术(FCM)等。表面等离子(SPR)生物传感器无标签，但其灵敏度低、成本高而不利于其广泛应用；酶联免疫法(ELISA)虽然快速但其灵敏度低；PCR有高度的灵敏性和选择性，但是样品中死亡的细胞或者生物碎片会导致错误的结果，故不适合用于食品和生物制品的检测；RCA技术需要锁式探针、连接酶和探针环化过程，反应时间较长(约4h)；FCM分析检测限高，且不适合复杂基质的样品的检测。因此，为了对食源性疾病进行更加有效的预防和监控，开发出一种新型的简单、快速检测手段非常关键。

技术实现思路

[0004]为解决现有技术的不足，现提供一种荧光偏振检测幽门螺旋杆菌的方法。
[0005]一种荧光偏振检测幽门螺旋杆菌的方法，具体包括以下步骤：
[0006]S1、金纳米粒子的制备：
[0007]取锥形瓶加入双蒸水，将其放在加热的磁力搅拌器上，保鲜膜封口加热至沸腾，重复洗四次，将氯金酸溶液加入到含有双蒸水的锥形瓶中，搅拌五秒后关闭搅拌装置，微沸时快速加入柠檬酸三钠溶液，打开搅拌装置，观察溶液颜色变化，由黑色变为紫色再变为酒红色，待颜色稳定时，关闭加热装置，间隔几分钟后关闭搅拌装置，得到金纳米粒子，冷藏保存；
[0008]S2、纳米球复合物的组装：
[0009]1)适配体
‑
互补链的杂交：将适配体探针、互补链探针、缓冲液a加入PCR管中，在30～40℃下保持40～50min获得适配体
‑
互补链的杂交物；
[0010]2)纳米球复合物的组装：在适配体
‑
互补链杂交物中加入金纳米粒子溶液，涡旋混匀后冷冻初步得到纳米球复合物，将初步得到的纳米球复合物用缓冲液b去除多余的未结合的探针，用缓冲液b溶解，得到最终的纳米球复合物；
[0011]S3、幽门螺旋杆菌的检测：建立标准曲线利用荧光偏振仪对幽门螺旋杆菌进行检测；
[0012]S4、对含幽门螺旋杆菌的实际样品进行定量检测。
[0013]优选地，所述S3检测的具体步骤为：在PCR管中加入纳米球和不同浓度的幽门螺旋杆菌，涡旋混合进行反应，将反应结束后的溶液加入到装有Tris
‑
buffer的玻璃管中，涡旋混匀后放入荧光偏振仪中测量FP值，以不同浓度的幽门螺旋杆菌为横坐标，以荧光偏振的信号值为纵坐标，建立幽门螺旋杆菌检测的标准曲线。
[0014]优选地，所述S4中定量检测的具体步骤为：将未知浓度的幽门螺旋杆菌作为检测目标，按照S3的处理方法进行荧光偏振检测，将得到的FP值代入幽门螺旋杆菌的标准曲线，计算幽门螺旋杆菌的浓度。
[0015]优选地，所述S1中氯金酸的浓度为2～8g/L。
[0016]优选地，所述S2中适配体探针的体积摩尔浓度为10μM、互补链探针的体积摩尔浓度为10μM、缓冲液a的体积摩尔浓度为10mM。
[0017]优选地，所述S1中柠檬酸三钠溶液的浓度为1％。
[0018]优选地，所述S2缓冲液a中NaCl的体积摩尔浓度为5mM,MgCl2的体积摩尔浓度为5mM。
[0019]优选地，所述S2缓冲液b中Na2HPO4的体积摩尔浓度为5mM,MgCl2的体积摩尔浓度为5mM。
[0020]有益效果：
[0021](1)与现有的检测方法相比，本专利技术提供的基于金纳米粒子和幽门螺旋杆菌适配体的纳米球介导的荧光偏振检测幽门螺旋杆菌的方法，通过对幽门螺旋杆菌定量和定性的检测获得较高的灵敏度，动态响应范围为0.9CFU/mL至0.9
×
107CFU/mL。
[0022](2)本检测方法通过简单的更换适配体可适用于其他细菌的检测。
[0023](3)本检测方法简单、方便、快速且成本低廉。
附图说明
[0024]图1是幽门螺旋杆菌标准溶液检测得到的标准曲线图。
具体实施方式
[0025]为了加深对本专利技术的理解，下面将结合实施例和附图对本专利技术作进一步详述，该实施例仅用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术保护范围的限定。
[0026]实施例一：
[0027]一种荧光偏振检测幽门螺旋杆菌的方法，主要包括以下步骤：
[0028](1)金纳米粒子的制备：
[0029]取出崭新的250mL的锥形瓶放在水龙头下冲洗干净，之后向干净的锥形瓶中加入150mL双蒸水，将其放在加热的磁力搅拌器上，保鲜膜封口加热至沸腾。用湿毛巾将煮沸的双蒸水倒出，重新加入双蒸水，重复洗四次。将2.55mL 5g/L的氯金酸溶液加入含有双蒸水的锥形瓶中，搅拌五秒后关闭搅拌装置，待搅拌子中有少量大的气泡时，快速加入4mL1％的柠檬酸三钠溶液，打开搅拌装置，观察溶液颜色(黑色
‑
紫色
‑
酒红色)，待颜色稳定后，关闭
加热装置，五分钟之后关闭搅拌装置，获得稳定的金纳米粒子(AuNP)，温度降至室温后放入4℃冰箱保存。
[0030](2)纳米球复合物的组装：
[0031]①
适配体
‑
互补链的杂交：将5μL，10μM适配体探针，5μL，10μM互补链探针与5μL，10mM Tris
‑
HCl缓冲液(5mM NaCl、5mM MgCl2)加入到PCR管中，在37℃条件下保持45min，获得适配体
‑
互补链的杂交物。
[0032]②
纳米球复合物的组装：在适配体
‑
互补链杂交物中加入185μl金纳米粒子溶液，涡旋混匀后放入
‑
20℃冷冻60min，之后就得到纳米球复合物。将获得的纳米球复合物用0.2
×
PBS缓冲液(5mM Na2HPO4、5mM MgCl2)以8000rpm离心10min去除多余的未结合的探针，用0.2
×
PBS缓冲液(5mM Na2HPO4、5mM本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种荧光偏振检测幽门螺旋杆菌的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：S1、金纳米粒子的制备：使用双蒸水对锥形瓶进行洗瓶，洗瓶后再次在锥形瓶中加入双蒸水，将氯金酸加入锥形瓶中,微沸时加入柠檬酸三钠溶液，打开搅拌装置，观察颜色变化，当颜色稳定时关闭搅拌装置，制备得到金纳米粒子；S2、纳米球复合物的组装：1)适配体
‑
互补链的杂交：将适配体探针、互补链探针、缓冲液a加入PCR管中，在30～40℃下保持40～50min获得适配体
‑
互补链的杂交物；2)纳米球复合物的组装：在适配体
‑
互补链杂交物中加入金纳米粒子溶液，涡旋混匀后冷冻初步得到纳米球复合物，将初步得到的纳米球复合物用缓冲液b去除多余的未结合的探针，用缓冲液b溶解，得到最终的纳米球复合物；S3、幽门螺旋杆菌的检测：建立标准曲线利用荧光偏振仪对幽门螺旋杆菌进行检测；S4、对含幽门螺旋杆菌的实际样品进行定量检测。2.根据权利要求1所述的一种荧光偏振检测幽门螺旋杆菌的方法，其特征在于，所述S3检测的具体步骤为：在PCR管中加入纳米球和不同浓度的幽门螺旋杆菌，涡旋混合进行反应，将反应结束后的溶液加入到装有Tris
‑
buffer的玻璃管中，涡旋混...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐建国，尚慧杰，姚丽，黄纯，尹余波，
申请(专利权)人：江苏海尔森生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：