人表皮干细胞的分离培养方法及装置制造方法及图纸

本发明专利技术公开一种人表皮干细胞的分离培养方法及装置，涉及干细胞培养技术领域。本发明专利技术分离培养方法包括材料选取、预处理、表皮修剪过滤、酶消化吹打、过滤离心、单细胞悬液制备、恒温孵育培养，采集小儿包皮后，清洗消毒去除皮下组织，与现有技术区别在于通过分离培养装置完成其中的表皮修剪过滤、酶消化吹打、过滤离心工序，分离培养装置能够提高表皮修剪效率，保持酶消化过程中的温度恒定，并且进行表皮干细胞液的自动收集，便于后续的单细胞悬液制备和恒温孵育培养工序，该分离培养方法的分离培养效率高，分离得到的人表皮干细胞纯度高，倒置显微镜观察呈卵圆形或多角形且细胞之间紧密相连。间紧密相连。间紧密相连。

【技术实现步骤摘要】
人表皮干细胞的分离培养方法及装置


[0001]本专利技术涉及干细胞培养
，具体涉及人表皮干细胞的分离培养方法及装置。

技术介绍

[0002]近年来仿照皮肤的生理结构，人们构建各种组织工程皮肤，有望解决皮源短缺及预后瘢痕的问题，其种子细胞主要是表皮干细胞、成纤维细胞等。因此，表皮干细胞的分离、培养就成了必须面对的问题。在以往的报道中人表皮干细胞的培养常采用中性蛋白酶消化过夜分离表皮层，再以0.25％胰蛋白酶37℃消化10～15min分离表皮干细胞，但实际应用中发现存在细胞活力差，产率低等缺点。
[0003]现有技术中人表皮干细胞的分离培养方法及装置，存在以下技术问题：人工修剪表皮效率低，无法保持酶消化过程中的温度恒定；缺少对表皮进行修剪、酶消化、过滤离心的一体化装置，降低了分离培养的效率。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种人表皮干细胞的分离培养方法及装置，用于解决现有技术中人工修剪表皮效率低，无法保持酶消化过程中的温度恒定；缺少对表皮进行修剪、酶消化、过滤离心的一体化装置，降低了分离培养的效率的技术问题。
[0005]本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：
[0006]人表皮干细胞的分离培养方法，包括以下步骤：
[0007]步骤一，材料选取、预处理：选取2～6岁的小儿包皮，使用碘伏浸泡5～10min，酒精脱碘，无菌条件下去除皮下组织，剩余组织修剪出1cm
×
1cm大小的皮片，皮片使用Dispase酶在3～5℃下避光消化12～14小时，分离得到表皮和真皮；
[0008]步骤二，表皮修剪过滤：表皮通过人表皮干细胞的分离培养装置，修剪过滤得到修剪后表皮；
[0009]步骤三，酶消化吹打：修剪后表皮通过0.25wt％的胰蛋白酶在37℃消化10～15min；加入胎牛血清终止消化，吹打得到吹打液；其中，胰蛋白酶中含有0.04wt％的EDTA；
[0010]步骤四，过滤离心：吹打液过滤后，以1400～1600rpm转速离心分离5～8min，静置分层得到上层的上清液和下层的表皮干细胞液；
[0011]步骤五，单细胞悬液制备：通过倒置显微镜观察表皮干细胞液内的细胞，计数后决定重悬细胞的培养基量，加入适量K
‑
SFM培养液，重悬细胞，计数，调整细胞浓度至5
×
105个/mL，制成单细胞悬液；
[0012]步骤六，恒温孵育培养：单细胞悬液接种于预先使用Ⅳ型胶原铺板的六孔板中，恒温孵育过夜，24小时后换培养液，置于37℃、5％CO2环境下继续培养，之后每隔2～3天换培养液，当细胞生长融合到70％时传代。
[0013]进一步的，步骤二的具体过程为：沿进料斗加入与真皮层分离后的表皮，启动表皮
修剪腔内的第一电机，第一电机通过第一联轴器驱动修剪轴、修剪叶片转动，多个修剪叶片对表皮进行修剪切割，从吹扫箱内吹出的空气使表皮在表皮修剪腔内无序漂浮，达到过滤板滤孔尺寸要求的修剪后表皮经过滤板过滤后经过滤通道有序的落入消化罐内。
[0014]进一步的，步骤三的具体过程为：将0.25wt％的胰蛋白酶从进液斗加入，电动马达驱动凸轮转动，凸轮往复性地推动推拉头，推拉头推动推拉杆向注液腔内部挤压，胰蛋白酶在压力下被推动至注液管内，均匀滴落至消化罐内；PTC发热件由导线通电后发热升温，PLC控制器与温度传感器通信连接，PLC控制器与PTC发热件电连接，当温度传感器检测到温度达到37℃时，发送控制信号至PLC控制器，PLC控制器关闭PTC发热件的导通电路，使得消化罐内的液体温度保持在37℃；
[0015]消化结束后，将胎牛血清从进液斗加入，电动马达驱动凸轮转动，凸轮往复性地推动推拉头，推拉头推动推拉杆向注液腔内部挤压，胎牛血清在压力下被推动至注液管内，均匀滴落至消化罐内；胎牛血清添加完毕后，通过注液管缓慢推入空气吹打细胞得到吹打液；吹打液经单向阀、排液管排出至离心管内。
[0016]人表皮干细胞的分离培养装置，包括分离培养箱，分离培养箱内从上至下依次设有表皮修剪腔、吹扫过滤腔、消化吹打腔和离心分离腔；表皮修剪腔的上方设有第一电机，第一电机通过第一联轴器连接有伸入表皮修剪腔内的修剪轴，修剪轴的外围设有多个修剪叶片，表皮修剪腔与吹扫过滤腔之间设有过滤板，过滤板与分离培养箱的内壁之间设有稳固板，稳固板上设有朝向表皮修剪腔中心的吹扫箱；吹扫过滤腔内设有与过滤板连通的多个分隔板，相邻的分隔板之间形成过滤通道，表皮修剪腔的顶部设有进料斗。
[0017]进一步的，所述吹扫过滤腔内设有若干个鼓风机，吹扫箱的底部设有贯穿稳固板的鼓风管，鼓风管通过连接法兰与鼓风机连通，吹扫箱的上表面均匀分布有多个吹扫头，吹扫头的端部分布多个吹扫孔。
[0018]进一步的，所述消化吹打腔的中心设有消化固定框，消化固定框的两侧设有恒温加热机构，消化固定框内固定有消化罐，消化固定框的壁部均匀分布有通风孔；分离培养箱的外壁两侧位于消化吹打腔处分别设有酶注入机构和胎牛血清注入机构。
[0019]进一步的，所述恒温加热机构包括恒温加热箱、PLC控制器和温度传感器，温度传感器设于消化固定框的外壁，恒温加热箱包括两侧开口的恒温加热框，恒温加热框内腔等距分布多个铝管，铝管与恒温加热框的内壁之间、相邻的铝管之间连接有导热管，铝管内插置有PTC发热件，恒温加热框的壁部贯穿设有传热孔。
[0020]进一步的，所述消化固定框的底部中心通过第二联轴器连接有第二电机，第二电机的外围设有电机固定框；消化罐的底部连接有贯穿消化固定框的多个单向阀，多个单向阀的底部连接有向下延伸的排液管。
[0021]进一步的，所述酶注入机构和胎牛血清注入机构的结构相同，均包括固定板、注液腔和注液管，固定板、注液腔与分离培养箱的外壁连接，注液管的一端与注液腔连通，另一端倾斜向下延伸至消化罐的上方，注液腔的顶部设有进液斗，注液腔内远离分离培养箱外壁适配设有推拉杆，推拉杆的端部连接有伸出注液腔的推拉头，推拉头的外侧设有凸轮，凸轮通过置于固定板上的电动马达驱动旋转。
[0022]进一步的，所述离心分离腔内设有离心分离机构，离心分离机构包括第三电机、缓振箱和离心分离箱，第三电机设于分离培养箱的底部，缓振箱和离心分离箱设于离心分离
腔内底部，离心分离箱设于缓振箱的上方，第三电机通过第三联轴器连接有伸入缓振箱内的离心轴，缓振箱的内腔上方设有若干个缓振弹簧；离心分离箱的上表面环形阵列分布多个与排液管对应的离心管，离心管的内腔上方设有筛网，离心管的底部通过分液管连接有集液腔。
[0023]本专利技术具备下述有益效果：
[0024]1、人表皮干细胞的分离培养方法，采集小儿包皮后，清洗消毒去除皮下组织，通过分离培养装置完成其中的表皮修剪过滤、酶消化吹打、过滤离心工序，分离培养装置能够提高表皮修剪效率，保持酶消化过程中的温度恒定，并且进行表皮干细胞液的自动收集，便于后续的单细胞悬液制备和恒温孵育培养工序，该分离培养方法的分离培养效率高，分离得到的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.人表皮干细胞的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一，材料选取、预处理：选取2～6岁的小儿包皮，使用碘伏浸泡5～10min，酒精脱碘，无菌条件下去除皮下组织，剩余组织修剪出1cm
×
1cm大小的皮片，皮片使用Dispase酶在3～5℃下避光消化12～14小时，分离得到表皮和真皮；步骤二，表皮修剪过滤：表皮通过人表皮干细胞的分离培养装置，修剪过滤得到修剪后表皮；步骤三，酶消化吹打：修剪后表皮通过0.25wt％的胰蛋白酶在37℃消化10～15min；加入胎牛血清终止消化，吹打得到吹打液；其中，胰蛋白酶中含有0.04wt％的EDTA；步骤四，过滤离心：吹打液过滤后，以1400～1600rpm转速离心分离5～8min，静置分层得到上层的上清液和下层的表皮干细胞液；步骤五，单细胞悬液制备：通过倒置显微镜观察表皮干细胞液内的细胞，计数后决定重悬细胞的培养基量，加入适量K
‑
SFM培养液，重悬细胞，计数，调整细胞浓度至5
×
105个/mL，制成单细胞悬液；步骤六，恒温孵育培养：单细胞悬液接种于预先使用Ⅳ型胶原铺板的六孔板中，恒温孵育过夜，24小时后换培养液，置于37℃、5％CO2环境下继续培养，之后每隔2～3天换培养液，当细胞生长融合到70％时传代。2.根据权利要求1所述的人表皮干细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤二的具体过程为：沿进料斗(38)加入与真皮层分离后的表皮，启动表皮修剪腔(20)内的第一电机(21)，第一电机(21)通过第一联轴器(22)驱动修剪轴(23)、修剪叶片(24)转动，多个修剪叶片(24)对表皮进行修剪切割，从吹扫箱(27)内吹出的空气使表皮在表皮修剪腔(20)内无序漂浮，达到过滤板(25)滤孔尺寸要求的修剪后表皮经过滤板(25)过滤后经过滤通道(32)有序的落入消化罐(42)内。3.根据权利要求1所述的人表皮干细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤三的具体过程为：将0.25wt％的胰蛋白酶从进液斗(74)加入，电动马达(78)驱动凸轮(77)转动，凸轮(77)往复性地推动推拉头(76)，推拉头(76)推动推拉杆(75)向注液腔(72)内部挤压，胰蛋白酶在压力下被推动至注液管(73)内，均匀滴落至消化罐(42)内；PTC发热件(67)由导线通电后发热升温，PLC控制器(62)与温度传感器(63)通信连接，PLC控制器(62)与PTC发热件(67)电连接，当温度传感器(63)检测到温度达到37℃时，发送控制信号至PLC控制器(62)，PLC控制器(62)关闭PTC发热件(67)的导通电路，使得消化罐(42)内的液体温度保持在37℃；消化结束后，将胎牛血清从进液斗(74)加入，电动马达(78)驱动凸轮(77)转动，凸轮(77)往复性地推动推拉头(76)，推拉头(76)推动推拉杆(75)向注液腔(72)内部挤压，胎牛血清在压力下被推动至注液管(73)内，均匀滴落至消化罐(42)内；胎牛血清添加完毕后，通过注液管(73)缓慢推入空气吹打细胞得到吹打液；吹打液经单向阀(47)、排液管(48)排出至离心管(57)内。4.人表皮干细胞的分离培养装置，其特征在于，包括分离培养箱(10)，分离培养箱(10)内从上至下依次设有表皮修剪腔(20)、吹扫过滤腔(30)、消化吹打腔(40)和离心分离腔(50)；表皮修剪腔(20)的上方设有第一电机(21)，第一电机(21)通过第一联轴器(22)连接有伸入表皮修剪腔(20)内的修剪轴(23)，修剪轴(23)的外围设有多个修剪叶片(24)，表皮
修剪腔(20)与吹扫过滤腔...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈志超，赵振民，张心灵，李义，
申请(专利权)人：北京大学第三医院北京大学第三临床医学院，
类型：发明
国别省市：