一种启动子文库及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种启动子文库，以及该启动子文库的构建方法及其应用。本发明专利技术的启动子文库包括来源于类球红细菌的启动子或其的修饰变体。本发明专利技术公开了该启动子文库中各启动子的核酸序列，含有所述启动子的核酸序列的载体和宿主细胞。本发明专利技术还公开了所述启动子文库的筛选方法，获得了强度梯度分布的启动子文库，可实现目的基因的高表达或低表达和/或可实现对其表达的微调。其表达的微调。其表达的微调。

【技术实现步骤摘要】
一种启动子文库及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物
；具体而言，涉及一种启动子文库，包含所述启动子的载体和/或宿主细胞、该启动子文库的构建方法以及启动子活性的筛选方法及其应用。

技术介绍

[0002]类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)是一种革兰氏阴性光合细菌，属于紫色非硫细菌中的α变形菌。类球红细菌代谢模式比较复杂，其可以通过光合作用获得能量维持生存，也可以在没有光照的情况下利用有机物进行有氧呼吸获得能量维持生命。数十年来，由于该菌含有大量光合色素，常被用作研究细菌光合作用的模式生物。除此之外，类球红细菌还有多种用途，例如合成用于治疗心血管疾病的辅酶Q
10
，该菌是其理想的宿主菌，生物安全性较高；还可以用于生物产氢、产聚
‑
β
‑
羟丁酸(poly
‑
β
‑
hydroxybutyrate，PHB)；现在也被用于膜蛋白表达系统。目前类球红细菌因以上特性，被广泛应用于食品、医药、农业等领域，存在极高的工业开发的潜在价值。
[0003]类球红细菌在低氧或者无氧的条件下，其细胞膜容易以发芽囊泡的形式内陷形成大量褶皱的细胞膜，分化产生胞浆内膜，形成胞浆内膜系统(Intracytoplasmic Membrane System，ICM)。ICM装配有光合作用装置用于捕捉光子进行厌氧光合作用，细菌通过该行为增加膜面积提高光合效率，由于辅酶Q
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广泛分布在生物膜上，这也可能为辅酶Q
10
提供了多贮存和发挥作用的空间。目前辅酶Q
10
积累机制尚未清晰，但类球红细菌作为模式菌株，全基因组测序已经于2005年完成，光合基因表达调控机制也已研究较清楚。ICM中主要包含的光反应中心和捕光复合物主要由一个光合基因簇表达合成，该光合基因簇中的基因的表达受到多个调控系统的调节，而且控制其中各操纵子表达的启动子也有独特特征，因而光合基因簇在阐明类球红细菌积累辅酶Q
10
机制以及构建天然启动子文库方面的潜力引起了所在课题组的注意。其中，类球红细菌的光合作用操纵子主要包括pucBAC、pufQKBALMX、crt、bch等，其下包含pucA、pucB、pufA、pufB、pufL、pufM、puhA等基因。前人研究还表明，PrrA/PrrB、PpaA、AppA/PpsR、FnrL和IHF等重要的调控蛋白能感应氧气浓度和光照强度，调节光合作用操纵子的表达。
[0004]启动子(Promoter)位于DNA编码链的5
’
端上游，含有使RNA聚合酶结合的保守序列，对基因的表达时序性和强度起着“控制开关”的作用。其主要包括上游原件、核心启动子区域和应答结合原件三部分。在原核生物中，启动子的核心区域主要包括
‑
10区“TATAAT”和
‑
35区“TTGACA”两部分，这两个保守区域能够和RNA聚合酶的σ因子相互识别，值得注意的是这种结合是具有特应性，因此使得启动子具有种属特异性。
‑
35区和
‑
10区保守区域的核苷酸数量的变化，能够影响基因转录的活性，一般认为强启动子为16
‑
18bp，当间距小于15bp或大于20bp时，启动子的活性会有所降低。
[0005]目前，类球红细菌中常用的天然启动子来自基因puf、pucP和aprrnB。puf和pucP基因均来自类球红细菌光合作用操纵子，与功能相适应，这两个基因的启动子受光和氧气的影响，可以在不同的培养条件下开启或关闭基因转录。P
rrnB
是类球红细菌核糖体RNA的启动
子，是一个中等强度的组成型启动子。另外，类球红细菌中的σ
93
和σ
37
RNA聚合酶可以兼容性地识别来源于大肠杆菌的σ
70
和σ
32
依赖型启动子，因此在类球红细菌中，来源于大肠杆菌的σ
70
依赖型启动子如大肠杆菌启动子P
lacUV5
、P
tac/trc
、P
Tn903kan
、P
A1/04/03
和P
rrnB P1
均能被类球红细菌的RNA聚合酶识别。Shan Q.等用P
J95025
、P
J95026
、J95027、P
tac
、P
rrnB
五种不同强度(其中P
rrnB
启动子并非其中强度最强的启动子)的启动子介导CrtY基因在类球红细菌中表达，其中在P
rrnB
启动子介导下，β
‑
胡萝卜素的产量提高109％。这表明适合的基因表达强度更有利于调控代谢网络实现产物产量提高，而现阶段类球红细菌的启动子文库有待开发。

技术实现思路

[0006]为了解决类球红细菌中的上述问题，本专利技术的专利技术人对类球红细菌的转录组和基因组进行了分析，获得了能够在类球红细菌中提供一系列转录强度的一组启动子。
[0007]由此，本专利技术的目的在于提供用于类球红细菌的启动子文库及其应用。本专利技术的另一目的在于提供本专利技术所述的启动子文库的构建方法。
[0008]在本专利技术的一个方面，提供了用于类球红细菌的启动子文库，所述启动子文库包括至少两条启动子，其中，启动子A包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO：1具有至少90％同一性的核苷酸序列，启动子B包含SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO：2具有至少90％同一性的核苷酸序列。
[0009]在一个优选的实施方式中，所述启动子文库进一步包括选自于由以下启动子所组成的组中的一条或多条：
[0010]启动子C，所述启动子C包含SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO：3具有至少90％同一性的核苷酸序列；
[0011]启动子D，所述启动子D包含SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO：4具有至少90％同一性的核苷酸序列；
[0012]启动子E，所述启动子E包含SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO：5具有至少90％同一性的核苷酸序列；
[0013]启动子F，所述启动子F包含SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO：6具有至少90％同一性的核苷酸序列；
[0014]启动子G，所述启动子G包含SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO：7具有至少90％同一性的核苷酸序列；
[0015]启动子H，所述启动子H包含SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO：8具有至少90％同一性的核苷酸序列；
[0016]启动子I，所述启动子I包含SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列或与SEQ本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种启动子文库，所述启动子文库包括至少两条启动子，其中，启动子A包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO：1具有至少90％同一性的核苷酸序列，启动子B包含SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO：2具有至少90％同一性的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的启动子文库，其中，所述启动子文库进一步包括选自于由以下启动子所组成的组中的一条或多条：启动子C，所述启动子C包含SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO：3具有至少90％同一性的核苷酸序列；启动子D，所述启动子D包含SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO：4具有至少90％同一性的核苷酸序列；启动子E，所述启动子E包含SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO：5具有至少90％同一性的核苷酸序列；启动子F，所述启动子F包含SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO：6具有至少90％同一性的核苷酸序列；启动子G，所述启动子G包含SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO：7具有至少90％同一性的核苷酸序列；启动子H，所述启动子H包含SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO：8具有至少90％同一性的核苷酸序列；启动子I，所述启动子I包含SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO：9具有至少90％同一性的核苷酸序列；和启动子J，所述启动子J包含SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO：10具有至少90％同一性的核苷酸序列。3.一种载...

【专利技术属性】
技术研发人员：张立新，谭高翼，石桐，张璐，王科峰，梁敏东，何昕蔚，周立铭，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：