一种基于微流控芯片超微注射筛选高活性氟化酶的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于微流控芯片高通量筛选氟化酶突变体的方法，包括如下步骤：(1)氟化酶的表面展示以及突变文库的建立；(2)基于微流控芯片建立的酶偶联荧光反应；(3)芯片设计和测试液滴孵育池的选择以及空液滴的弃置(4)筛选流程(5)突变体的复筛和活性验证以及测序验证筛选。本发明专利技术本发明专利技术提供的方法基于微流控芯片首次实现真正的(超)高通量筛选，从而大大提高了获取理想突变酶的几率。本发明专利技术设计的酶偶联方法和在芯片应用对背景信号、荧光淬灭和荧光染料扩散进行了提供了全新的可行的解决方案。解决方案。解决方案。

【技术实现步骤摘要】
一种基于微流控芯片超微注射筛选高活性氟化酶的方法


[0001]本专利技术公开了一种基于微流控芯片超微注射筛选高活性氟化酶的方法，属于基因和生物 工程领域。

技术介绍

[0002]虽然天然的氟化有机物十分稀有，但氟化物的价值却十分巨大。有机氟化物可以被广泛 的应用于生物有机化学，药物化学和生物材料等领域，尤其在医药领域，氟元素的特异性引 入能够提高利用率等。在药物分子和生物农药中，各约有25％分子含有氟元素。目前在化合 物中引入氟元素主要依靠化学合成的方法，但其存在反应条件剧烈、能耗高、产率低等不足。 生物法依靠氟化酶来合成有机氟化物，其反应温和、特异性高、环保等特性使其在氟化天然 产物的合成研究中已发挥越来越重要的作用。且氟化酶作为氟化物代谢途径的第一个酶，对 打通整个途径以及后续的代谢改造起到关键的作用。但是，自然界中的氟化酶极为罕见，且 具有底物镨窄、活性低等缺点，因此进行高通量筛选以获得高活性的氟化酶具有重要的意义。
[0003]目前氟化酶报道的筛选方法依靠液相检测(Sun et al.,2016)，而液相检测筛选通量非常低 并不能满足需求。我们设计全新方案腺苷甲硫氨酸与氟离子在氟化酶催化作用下反应生成5
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氟脱氧腺苷和甲硫氨酸，而氟化酶的检测是通过检测生成的甲硫氨酸。目前的甲硫氨酸主要 是通过茚三酮显色法或者通过液相直接检测。但是茚三酮显色检测法并不灵敏，也没有较好 的线性关系。我们提供全新的解决方案，通过设计的检测方法通过氨基酸氧化酶催化下生成 过氧化氢，偶联试卤灵荧光反应从实现检测氟化酶的活性。
[0004]试卤灵和二羟基试卤灵能够进入细胞产生背景干扰，通常需要离心去除活细胞取上清液 反应。对于多孔板筛选过程传统使用96孔板进行高通量筛选存在通量低，耗时长，成本高等 不足。近年来，随着微流控芯片技术的迅速发展，微流控技术逐步发展成一个全新的领域。 微流控技术具有通量高、试剂消耗少和自动化程度高等优点，在生物学、医学、化学等多个 领域都具有广泛应用，成为这些领域中关键的研究工具。目前，基于微流控技术的微液滴高 通量筛选技术备受研究人员的关注，特别是对胞外分泌活性小分子物质和酶蛋白的筛选。通 过将氟化酶展示在细胞表面，并与微流控技术连用，通过设计显色反应来实现高活性氟化酶 的高通量快速筛选。无论是多孔板筛选还是微流控液滴筛选，都需要解决荧光染料进入细胞 产生背景噪音问题，因此我们提供一个全新的解决方案。
[0005]试卤灵染料氧化还原反应具有简单快速、灵敏度高、试剂成本低的优点，通常作为代谢 活动的指示剂。而并没有直接应用于微流控筛选活动中。究其原因是在微流控应用存在三大 技术难题，我们针对在微流控应用中的三大技术难题提出全新的解决方案。(1)荧光染料的 液滴之间扩散问题；(2)荧光染料进入分子产生背景(3)荧光染料的稳定性问题，本专利技术 旨在于提供一种基于微流控技术筛选直接或者间接偶联NAD(P)+辅酶因子突变酶的通用筛 选方法。

技术实现思路

[0006]针对上述问题，本专利技术旨在于提供一种基于微流控芯片的超微注射技术以实现高通量筛 选氟化酶以提高其催化活性。
[0007]为实现上述专利技术目的，本专利技术的技术方案具体如下：
[0008]一种基于微流控芯片高通量筛选氟化酶突变体的方法，包括以下步骤：
[0009](1)在大肠杆菌表面展示突变酶；
[0010](2)建立氟化酶活性检测方法；
[0011](3)荧光染料的分子修饰和酰胺化后固定化；
[0012](4)通过表面展示氟化酶筛选出氟化酶突变体。
[0013]进一步的，所述步骤(1)包括：
[0014]构建表达菌株；
[0015]将构建好的表达菌株接种至加入硫酸卡那霉素的LB培养基中恒温过夜培养，然后接种 至含硫酸卡那霉素的TB培养基中恒温培养至OD600为0.6～0.8，然后加入IPTG进行诱导， 之后收集菌体。
[0016]进一步的，所述步骤(1)包括：
[0017]将实验室已经构建好带有氟化酶的质粒转化至E.coli BL21中；
[0018]将构建好的表达菌株接种至加入硫酸卡那霉素终浓度50μg/mL的LB培养基中37℃过夜 培养，然后按照体积的1％接种至硫酸卡那霉素终浓度50μg/mL的TB培养基中37℃培养至 OD600为0.6～0.8，然后加入IPTG终浓度为0.2
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0.5mmol/L进行诱导，诱导温度为20℃，诱 导约20小时收集菌体。
[0019]进一步的，所述步骤(2)包括：
[0020]将腺苷甲硫氨酸与氟离子在氟化酶催化作用下反应生成5
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氟脱氧腺苷和甲硫氨酸，通过 检测生成的甲硫氨酸检测化酶；是通过偶联两个酶反应实现对甲硫氨酸的检测。
[0021]进一步的，所述对甲硫氨酸的检测具体包括：首先将甲硫氨酸转化为过氧化氢，之后在 辣根过氧化酶催化下无色的二羟基试卤灵转化为试卤灵的荧光染料从而产生红色荧光信号。
[0022]进一步的，所述步骤(3)包括：
[0023]对荧光染料进行羧基化修饰并通过氨酰化反应与PEG与生物素分子结合，而生物分子可 以与链霉素结合从而实现染料分子的固定化；由于生物分子变大而无法进入细胞与胞内物质 发生从而从根本上解决背景噪音；另外染料分子量的变大也降低其在液滴之间的扩散，通过 用链霉亲和素变体的方式解决染料分子淬灭问题。
[0024]进一步的，所述步骤(4)包括：
[0025]通过设计配套芯片和实验流程；芯片设计包括液滴生成，包括以聚焦流等方式生成单细 胞包裹的液滴，信号孵育和空液滴去除，以及超微注射酶偶联荧光反应试剂后，进一步孵育 和最后介电电泳分选；在构建表面展示或者分泌表达时，同时融合表达单体绿色荧光蛋白 eGFP,此融合表达可以用于空液滴的弃置；通过双荧光检测排除表达水平波动所带来的的偏 差；反应试剂包括底物，辅酶因子和偶联酶都是通过超微注射进入液滴；由于这一类酶荧光 反应的信号是随着酶活的提高而提高的，其比值R＝红色荧光强度/绿色荧光强度越大，相应 的液滴里的突变酶的活性越强。
[0026]与现有技术相比，本专利技术的有益技术效果：
[0027](1)氟化酶为多亚基复合酶，而传统的表面展示方法常常面临活性较大的活性损失的问 题，自组装的方法能较好的避免这一问题。
[0028](2)基于微流控设计的筛选方法，具有灵敏性高、筛选通量高、自动化程度高和试剂成 本低的优点。
[0029](3)创新性的酶偶联荧光筛选方法，支持微流控筛选和平板筛选
[0030](4)特别针对应用的问题提供的解决方案。
附图说明
[0031]图1是本专利技术实施例的氟化酶活性检测方法原理图；
[0032]图2是专利技术实施例的氟化酶表达示意图。
具体实施方式
[0033]如图1所示，一种基于微流控芯片高通量筛选氟化酶突变体的方法，包括：
[0034](本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于微流控芯片高通量筛选氟化酶突变体的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)在大肠杆菌表面展示突变酶；(2)建立氟化酶活性检测方法；(3)荧光染料的分子修饰和酰胺化后固定化；(4)筛选出氟化酶突变体。2.根据权利要求1所述的一种基于微流控芯片高通量筛选氟化酶突变体的方法，其特征在于，所述步骤(1)包括：构建表达菌株；将构建好的表达菌株接种至加入硫酸卡那霉素的LB培养基中恒温过夜培养，然后接种至含硫酸卡那霉素的TB培养基中恒温培养至OD600为0.6～0.8，然后加入IPTG进行诱导，之后收集菌体。3.根据权利要求2所述的一种基于微流控芯片高通量筛选氟化酶突变体的方法，其特征在于，所述步骤(1)包括：将实验室已经构建好带有氟化酶的质粒转化至E.coli BL21(DE3)中；将构建好的表达菌株接种至加入硫酸卡那霉素终浓度50μg/mL的LB培养基中37℃过夜培养，然后按照体积的1％接种至硫酸卡那霉素终浓度50μg/mL的TB培养基中37℃培养至OD600为0.6～0.8，然后加入IPTG终浓度为0.2
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0.5mmol/L进行诱导，诱导温度为20℃，诱导约20小时收集菌体。4.根据权利要求1所述的一种基于微流控芯片高通量筛选氟化酶突变体的方法，其特征在于，所述步骤(2)包括：将腺苷甲硫氨酸与氟离子在氟化酶催化作用下反应生成5
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氟脱氧腺苷和甲硫氨酸，通过检测生成的甲硫氨酸检测化酶；是通过偶联两个酶反应实现对甲硫氨酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：余世琴，周景文，杨文涵，陈坚，堵国成，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：