蜻蜓凤梨AfCAL基因、克隆方法、表达载体及应用技术

本发明专利技术公开蜻蜓凤梨AfCAL基因、克隆方法、表达载体及应用，提取蜻蜓凤梨总RNA，反转录合成cDNA，以此为模板，设计特异引物，利用PCR方法获得AfCAL基因的全长cDNA，与载体连接，转化大肠杆菌Trans

【技术实现步骤摘要】
蜻蜓凤梨AfCAL基因、克隆方法、表达载体及应用


[0001]本专利技术属于生物
，涉及凤梨CAL基因、克隆、表达特性分析、表达载体构建和对开花的调控作用。

技术介绍

[0002]凤梨科植物为多年生单子叶草本植物，包括重要的热带花卉(观赏凤梨)和重要的热带水果(菠萝)。凤梨的开花时间、花期长短以及花形态建成会影响其上市时间、上市周期以及果实品质等。近年来越来越多参与凤梨开花途径的基因被分离和鉴定，但是CAL基因在凤梨花序发育和开花机制中研究较少。
[0003]CAL(CAULIFLOWER)是控制花分生组织发育和调控花发育的基因，属于MADS
‑
box转录因子编码基因，在拟南芥中，AP1(APETALA1)和CAL双突变使花分生组织保持无限分生特性，能形成和花椰菜相似的花球表型。而花椰菜中BobCAL基因单突变就能形成花球。虽然CAL基因与AP1基因在序列和结构上较相似，但在MADS结构域和K结构域的差异，对花器官原基的形成、花分生组织以及花瓣和萼片原基等有相互作用的影响，其功能上依然存在一定差异。MADS
‑
box转录因子往往与多个蛋白质形成同源或异源复合体来发挥特定功能，CAL和AP1功能的不同也很可能是其互作因子存在差异。已有研究分别筛选了拟南芥中CAL和AP1的互作因子，二者的确存在各自特异的互作蛋白，也同时存在共有的互作因子。
[0004]通过蜻蜓凤梨(Aechmea fasciata)比较转录组信息分析获得了CAL基因的片段，BLAST对比显示均与其他植物中的CAL基因具有较高的同源性，定名为AfCAL。实时荧光定量PCR结果表明，AfCAL基因在蜻蜓凤梨各器官中表达量存在显著差异。利用PCR克隆了基因的全长序列并构建表达载体，在拟南芥中过表达后促进了拟南芥开花。说明蜻蜓凤梨AfCAL基因具有调控植物开花的功能。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种蜻蜓凤梨AfCAL基因，提取蜻蜓凤梨总RNA，反转录合成cDNA，以此为模板，设计特异引物，利用PCR方法获得AfCAL基因的全长cDNA，与
‑
blunt载体连接，转化大肠杆菌Trans
‑
T1感受态细胞，挑取阳性克隆得到蜻蜓凤梨AfCAL基因，该基因的cDNA全长1315bp。AfCAL基因的获得，为研究蜻蜓凤梨开花机理奠定了基础，为凤梨植物栽培中催花技术的提高提供了理论参考，具有重要的理论及实践意义。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术的技术方案为：提供一种蜻蜓凤梨AfCAL基因，该基因序列具有序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
[0007]本专利技术的另一目的在于提供一种蜻蜓凤梨AfCAL基因的克隆方法，包括以下步骤：
[0008](1)以蜻蜓凤梨(Aechemia fasciata)为材料，利用CTAB法提取总RNA；
[0009](2)AfCAL基因的克隆；
[0010](2
‑
1)利用Trans
‑
Uni One
‑
Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(Transgene)试剂盒将RNA反转录为cDNA，作为PCR模板备用；
[0011](2
‑
2)设计全长cDNA扩增引物；
[0012]AfCAL基因cDNA全长克隆引物
[0013][0014](2
‑
3)根据引物的Tm值进行PCR条件的优化后，进行PCR扩增，并将获得的产物连接到
‑
blunt载体，并转化大肠杆菌感受态Trans
‑
T1，经PCR和酶切鉴定后进行测序。
[0015]PCR体系及条件为：
[0016][0017][0018][0019]获得全长的cDNA为1315bp，包括部分起始密码子前的5
’
UTR和终止密码子后的3
’
UTR。开放阅读框部分为759bp，由此推得编码含253个氨基酸残基的蛋白质，将此氨基酸序列在国际基因库中进行保守结构域分析，具有MADS家族保守功能结构域。
[0020]进一步地，步骤(1)总RNA的提取具体如下：
[0021](1
‑
1)准备工作：将研钵提前放入烘箱180℃烘4h后冷却至室温待用，实验过程中所要用的移液枪、实验台均用酒精擦拭，离心管、枪头均无RNA酶。
[0022](1
‑
2)取850μl CTAB缓冲液到2ml离心管中，放入65℃水浴锅预热。
[0023](1
‑
3)称取0.2g材料于加入液氮的研钵中充分研磨，待材料呈粉末状即可转入(1
‑
2)中预热的离心管中，加入材料前先加入25μlβ
‑
巯基乙醇。
[0024](1
‑
4)立即涡旋30s混匀，65℃水浴6min。
[0025](1
‑
5)加入等体积氯仿、异戊醇(24:1)，剧烈震荡，开盖放气，涡旋30s，室温11000rpm离心15min。
[0026](1
‑
6)吸取上清于新2ml离心管中，加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)再抽提一次，涡旋30s，室温11000rpm离心15min。
[0027](1
‑
7)吸取上清于新1.5ml离心管中，加入1/3体积8mol/l LiCl，颠倒混匀，在4℃下沉淀10
‑
12h，不要超过16h。
[0028](1
‑
8)4℃下，11000rpm离心30min，弃上清，用75％乙醇500μl洗涤沉淀两次，弃去液体，风干。
[0029](1
‑
9)加入30
‑
40μl RNase
‑
free水溶解沉淀。
[0030](1
‑
10)取2μl RNA样品用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，取2μl RNA样品用SimpliNano微量分光光度计测定样品的浓度与纯度，剩余RNA样品于
‑
80℃保存备用，保存时间不要超过一周。
[0031]进一步地，步骤(2
‑
2)中的扩增引物包括AfCAL
‑
F和AfCAL
‑
R的序列，序列分别如序列表中的SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示。
[0032]本专利技术的另一目的在于提供一种蜻蜓凤梨AfCAL基因表达载体，利用蜻蜓凤梨AfCAL基因为目的基因的表达载体。
[0033]进一步地，用蜻蜓凤梨AfCAL基因插入到植物表达载体CaMV35S
‑
gfp上，构建成在CaMV35S启动子下游含有蜻蜓凤梨AfCAL基因的高效表达载体。
[0034]蜻蜓凤梨AfC本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种蜻蜓凤梨AfCAL基因，其特征在于：该基因序列具有序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。2.一种蜻蜓凤梨AfCAL基因的克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)以蜻蜓凤梨为材料，利用CTAB法提取总RNA；(2)AfCAL基因的克隆；(2
‑
1)利用Transgene公司的
‑
Uni One
‑
Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix Kit将RNA反转录为cDNA，作为PCR模板备用；(2
‑
2)设计全长cDNA扩增引物；(2
‑
3)根据引物的Tm值进行PCR条件的优化后，进行PCR扩增，并将获得的产物连接到大肠杆菌，经PCR和酶切鉴定后进行序列测定。3.根据权利要求2所述的蜻蜓凤梨AfCAL基因的克隆方法，其特征在于，步骤(1)总RNA的提取具体如下：(1
‑
1)准备工作：将研钵提前放入烘箱180℃烘4h后冷却至室温待用，实验过程中所要用的移液枪、实验台均用酒精擦拭，离心管、枪头均无RNA酶；(1
‑
2)取850μl CTAB缓冲液到2ml离心管中，放入65℃水浴锅预热；(1
‑
3)称取0.2g材料于加入液氮的研钵中充分研磨，待材料呈粉末状即可转入(1
‑
2)中预热的离心管中，加入材料前先加入25μlβ
‑
巯基乙醇；(1
‑
4)立即涡旋30s混匀，65℃水浴6min；(1
‑
5)加入等体积氯仿/异戊醇，剧烈震荡，开盖放气，涡旋30s，室温11000rpm离心15min；(1
‑
6)吸取上清于新2ml离心管中，加入等体积氯仿/异戊醇再抽提一次，涡旋30s，室温11000rpm离心15min；(1
‑
7)吸取上清于新1.5ml离心管中，加入1/3体积8mol/l LiCl，颠倒混匀，在4℃下沉淀10
‑
12h，不要超过16h；(1
‑
8)4℃下，11000rpm离心30min，弃上清...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐立，荆永琳，王小冰，李志英，杨庆全，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所，
类型：发明
国别省市：