烟草腺毛启动子pNtGGPPS2a及其应用制造技术

本申请公开了烟草腺毛启动子pNtGGPPS2a及其应用。该启动子具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.1限定的DNA序列具有90％以上同源性、且具有相同的启动子活性的序列。所述启动子驱动目的基因在烟草叶片腺毛组织特异表达，而不会在叶片非腺毛组织中表达，避免了叶片中大量产生次生代谢物而对植株生长发育造成影响。本申请为利用烟草腺毛高效生产次生代谢物或为高香气烟草品种选育提供新的调控序列。新的调控序列。

【技术实现步骤摘要】
烟草腺毛启动子pNtGGPPS2a及其应用


[0001]本申请涉及植物基因工程
，尤其涉及烟草腺毛启动子pNtGGPPS2a及其应用。

技术介绍

[0002]腺毛是植物表皮细胞分化形成的特殊结构。腺毛能合成、储存和分泌一系列次生代谢物(如生物碱、尼古丁和萜烯等)来保护植物免受食草动物和昆虫的侵害，此外，腺毛又被称为代谢物合成的“小型工厂”，一些特殊的代谢物已成为具有重要商业价值的杀虫剂、食品添加剂、香料或药物成分等，如黄花蒿(Artemisia annua)中的青蒿素、薄荷(Mentha spicata)中的薄荷醇、大麻(Cannabis sativa)中的大麻素等代谢物都主要在腺毛中合成和储存。
[0003]烟草(Nicotiana tabacum L.)是一种重要的经济作物，烟草腺毛分泌物主要为西柏烷二萜、糖酯、烷烃以及挥发性的醛、酮、酸等组成的混合物，约占鲜烟叶重的0.5～10％，其中大部分成分对烟叶香气有重要贡献。研究表明，西柏烷二萜合成途径中的二个关键酶基因CBTS、CYP71D16均在腺毛中特异表达。
[0004]启动子是位于基因5'端上游的一段DNA序列，它能被RNA聚合酶识别并结合，调控目的基因在特定的时间或空间表达。
[0005]来自花椰菜花叶病毒的CaMV35S是目前植物基因工程中常用的组成性表达启动子，它可驱动目的基因在植物的任何发育阶段及组织部位中表达，但如果应用于生产次生代谢物时，这种组成性表达往往会使目的产物在整个植物体内积累，从而使植物生长出现异常。
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技术实现思路

[0006]现有技术中，常选用来自花椰菜花叶病毒的CaMV35S作为植物基因工程中组成性表达启动子，如上所述，CaMV35S启动子用于植物体内生产次生代谢物时，表达往往会使目的产物在整个植物体内积累，从而使植物生长出现异常，因而不利于提高烟草腺毛分泌产生对烟叶香气有重要作用的成份。
[0007]有鉴于此，腺毛组织特异性启动子能驱动目的基因在腺毛中特异表达，有效避免了外源基因表达(或内源基因过表达)时，对植物生长发育造成危害。因此，本申请构思在于提供一种烟草腺毛启动子，所述启动子驱动目的基因在烟草腺毛的特异表达。
[0008]第一方面，本申请实施例公开了一种烟草腺毛启动子pNtGGPPS2a，所述启动子驱动目的基因在烟草叶片腺毛组织特异表达，所述启动子核苷酸序列为(I)或(II)的一种：
[0009](I)如SEQ ID NO.1所示；
[0010](II)与SEQ ID NO.1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且具有相同的启动子活性的序列。
[0011]第二方面，本申请实施例提供了扩增第一方面所述启动子的引物对，所述引物对
的序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
[0012]第三方面，本申请实施例提供了第一方面所述启动子的制备方法，其制备方法如下：
[0013]提取烟草基因组DNA；
[0014]从基因组DNA中克隆启动子pNtGGPPS2a；
[0015]启动子pNtGGPPS2a进行顺式作用元件分析；
[0016]构建pCAMBIA1391Z
‑
pNtGGPPS2a::GUS植物表达载体；
[0017]培养烟草无菌苗，并将pCAMBIA1391Z
‑
pNtGGPPS2a::GUS载体遗传转化至烟草无菌苗中，获得转基因烟草；
[0018]对转基因烟草进行GUS染色；
[0019]qRT
‑
PCR检测NtGGPPS2a基因在烟草腺毛中的相对表达情况。
[0020]进一步地，所述的遗传转化过程是通过农杆菌介导将重组质粒转化至烟草中。
[0021]第四方面，本申请实施例提供了第一方面所述启动子在烟草基因工程育种的应用，具体为：
[0022]所述启动子驱动目的基因在烟草腺毛部位表达，高效生产次生代谢物以定向培育高香气烟草新品种。
[0023]第五方面，本申请实施例公开了一种核酸分子，所述核酸分子包含第一方面所述启动子的序列。
[0024]第六方面，本申请实施例公开了包含第五方面的核酸分子的嵌合基因，所述核酸分子嵌合连接至异源核酸分子。
[0025]在本申请实施例中，所述异源核酸分子编码蛋白或肽。
[0026]第七方面，本申请实施例公开了包含第五方面的核酸分子的载体。
[0027]第八方面，本申请实施例公开了包含第七方面的载体的宿主细胞。
[0028]与现有技术相比，本申请至少具有以下有益效果之一：
[0029]本申请为烟草分子育种提供了一种新方法。这种方法包括将启动子pNtGGPPS2a与目标基因连接后转入烟草中，通过该启动子在腺毛组织中驱动目的基因的表达，提高生产次生代谢物的效率，对于烤烟新品种选育、提高烟草的香气品质都具有十分重要的价值。
附图说明
[0030]图1为本申请实施例提供的启动子pNtGGPPS2a的PCR扩增电泳图。
[0031]图2为本申请实施例提供的启动子pNtGGPPS2a顺式作用元件分析图。
[0032]图3为本申请实施例提供的pCAMBIA1391Z
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pNtGGPPS2a::GUS载体构建图。
[0033]图4为本申请实施例提供的pCAMBIA1391Z
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pNtGGPPS2a::GUS转基因烟草叶片GUS染色图。
[0034]图5为本申请实施例提供的NtGGPPS2a基因在烟草不同组织中的相对表达量。
具体实施方式
[0035]为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于
限定本申请。本申请中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。
[0036]根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本申请的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本申请的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本申请的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本申请实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
[0037]在本申请中，术语“基因”指表达特定蛋白质或功能RNA分子的核酸片段，该核酸片段可包含位于编码序列之前的调节序列(5
′
非编码区)和之后的调节序列(3
′
非编码区)。
[0038]在本申请中，“天然基因”指具有其自身调控序列的天然存在的基因。“嵌合基因”指不是天然基因的任何基因，包含在天然情况下不是一起存在的调控序列和编码序列。因此，嵌合基因可包括源于不同来源的调控序列和编码序列，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种烟草腺毛启动子pNtGGPPS2a，所述启动子驱动目的基因在烟草叶片腺毛组织特异表达，所述启动子核苷酸序列为(I)或(II)的一种：(I)如SEQ ID NO.1所示；(II)与SEQ ID NO.1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且具有相同的启动子活性的序列。2.扩增权利要求1所述启动子的引物对，其中所述引物对的序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。3.权利要求1所述启动子的制备方法，其制备方法如下：提取烟草基因组DNA；从基因组DNA中克隆启动子pNtGGPPS2a；启动子pNtGGPPS2a进行顺式作用元件分析；构建pCAMBIA1391Z
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pNtGGPPS2a::GUS植物表达载体；培养烟草无菌苗，并将pCAMBIA1391Z
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【专利技术属性】
技术研发人员：余婧，赵会纳，雷波，王兵，郭玉双，贾蒙骜，
申请(专利权)人：贵州省烟草科学研究院，
类型：发明
国别省市：