用生长调节因子(GRF)、GRF相互作用因子(GIF)或嵌合GRF-GIF改进植物再生的方法技术

公开了具有改进的再生效率的产生植物的方法，所述方法使用生长调节因子(GRF)、GRF相互作用因子(GIF)或嵌合GRF

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用生长调节因子(GRF)、GRF相互作用因子(GIF)或嵌合GRF
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GIF改进植物再生的方法
[0001]相关申请的引用
[0002]本申请要求先前在2019年7月11日提交的共同未决申请USSN 62/873,123的优先权，其内容通过引用全文纳入本文。
[0003]关于联邦资助研究的声明
[0004]本专利技术在美国农业部、国家粮食和农业研究所授予的资助号2017
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67007
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25939下由政府支持完成。政府对本专利技术拥有一定权力。
[0005]序列表
[0006]本专利技术包含以ASCII格式经EFS
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Web提交的序列，并通过引用全文纳入本文。所述ASCII拷贝创建于2020年5月27日，名为P1322WO00_SEQLISTING_06
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17
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2020_ST25且大小为385,059字节。

技术介绍

[0007]现在，植物育种和基因工程已经使用了好几十年以改善植物性能和提供植物尤其是农作物的农业改良。植物转化技术的一个缺点是某些植物的再生效率低，包括选择植物属和种且甚至植物种内特定基因型的低效率。因此，需要改进植物的再生效率。
[0008]专利技术概述
[0009]本方法要提高植物再生效率。所述方法采用向一个或多个植物细胞的引入生长调节因子(GRF)和/或GRF相互作用因子蛋白(GIF)(其引入植物细胞)，或引入植物细胞的GRF
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GIF嵌合体。引入编码多肽的核酸分子或引入所述多肽提高再生效率。在某些实施方案中，所述方法提高低再生效率植物的再生效率。其他实施方案加速产生转基因植物的时间。提供实施方案用于突变GRF序列的miR396靶区域，以降低植物细胞中GRF蛋白受miR396的阻遏。还提供其他实施方案，其中植物细胞内存在GRF和GIF或GRF
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GIF嵌合多肽，允许细胞在培养基上再生，该培养基的细胞分裂素浓度对于不包含所引入的多肽的植物细胞再生而言过低。可在这类培养基上选择植物，而不需额外标记序列。在某些实施方案中，用GRF和/或GIF或GRF
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GIF转化的植物具有高再生效率，用于后续转化实验。GRF和/或GRF或GRF
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GIF嵌合体与诱导型启动子或结构域可操作连接，还允许选择多肽表达或活性的时间。在某些实施方案中，用GRF和/或GIF或GRF
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GIF转化的植物具有高再生效率，用于后续转化实验。还提供其他实施方案，其中GRF、GIF或GRF
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GIF嵌合体与基因编辑技术组合，且GRF、GIF或GRF
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GIF嵌合体以及基因编辑构建体可通过经编辑的植物后代中的隔离(segregation)来移除。


[0010]一般而言，本公开涉及植物再生方法。更具体地，本公开涉及通过用生长调节因子(GRF)和/或GRF相互作用因子(GIF)或GRF
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GIF嵌合体转化改进植物再生效率的方法。
[0011]附图简要说明
[0012]图1.A
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C)用邻接法的分子系统发育分析。A)拟南芥(Arabidopsis)、小鼠和小麦
GRF蛋白。B)拟南芥、小鼠和小麦GIF蛋白。C)通过小麦UBIQUITIN启动子表达的小麦GRF4
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GIF1嵌合体方案。
[0013]图2.细胞分裂素再生培养基中的愈伤组织。在Ubi::GRF4
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GIF1嵌合体(SEQ ID NO:5，中间)存在下于Kronos转化期间再生的芽(shoot)数量高于用同一载体但没有GRF
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GIF嵌合体的Kronos转化(如两侧所示)。
[0014]图3.A)通过PCR验证26个独立转化事件。用引物Fw
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GRF4b和Rev
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GIF1b获得PCR产物，使用分离自26株独立T0植物的基因组DNA作为模板。各数字对应于独立转化事件。L＝DNA梯状长度标记(ladder)。B)GRF4
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GIF1嵌合体和用于基因分型的引物的示意图。扩增片段是1.087Kb。
[0015]图4.细胞分裂素再生培养基中的愈伤组织。Ubi::GIF1(SEQ ID NO:2)存在下小麦转化期间的芽再生，和使用同一载体但没有GIF1基因的小麦转化中的芽再生。
[0016]图5.细胞分裂素再生培养基中的愈伤组织。用Ubi::GRF4(SEQ ID NO:1),Ubi::GIF1(SEQ ID NO:2),Ubi::GRF4
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GIF1嵌合体(SEQ ID NO:5)转化的植物细胞的再生效率与对照作比较。
[0017]图6.GRF4
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GIF1嵌合体对从叶片外植体的再生的影响。
[0018]图7.A)小麦转化不同步骤的示意图。B)GRF4
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GIF1嵌合体对没有细胞分裂素情况下诱导胚发生的影响。
[0019]图8.由小麦UBIQUITIN启动子(SEQ ID NO:59)表达的小麦GRF4
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GIF1嵌合体方案。以下是野生型miR396靶位点(顶部(SEQ ID NO:53)、带有沉默突变的miR396
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抗性位点(底部(SEQ ID NO:54)和其与miR396相互作用(中间(SEQ ID NO:55))的序列。
[0020]图9.A)用构建体转化的植物细胞的芽再生，所述构建体包含GRF4
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GIF1嵌合体、Cas9和靶向基因Q的引导RNA(gRNA)。B)用引导RNA靶向的基因Q区域(SEQ ID NO:68)。C)确认靶基因的编辑。
[0021]图10.用GRF4
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GIF1嵌合体转化的植物细胞的芽再生，其在十分之一的正常细胞分裂素浓度生长。
[0022]图11.小麦嵌合克隆的编码序列。A)小麦GRF4
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GIF1的核苷酸序列。序列来自四倍体小麦Kronos。B)小麦GRF4
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GIF1编码蛋白的序列。蓝色的序列来自GRF4，黑色为间隔子，绿色为GIF1。
[0023]图12.pLC41
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Ubi::GRF4
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GIF1的序列(SEQ ID NO:5)。GRF4序列采用蓝色字母，间隔子是黑色的，GIF序列采用绿色字母。Ubi启动子以灰色突出显示，HA标签为红色，NOS终止子为粉色，35S启动子为绿色，HPT为黄色。LB(GTTTACACCACAATATATCCTGCCA)(SEQ ID NO:57)和RB(GTTTACCCGCCAATATATCCTGTCA)(SEQ ID NO:58)序列带有下划线。
[0024]图13.酿酒葡萄(Vitis vinifera)GRF4本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种提高一个或多个转基因植物细胞再生效率的方法，所述方法包括：a)向所述一个或多个植物细胞引入编码以下的核酸分子或包含以下的多肽，i)生长调节因子(GRF)多肽和/或GRF相互作用因子(GIF)多肽；或ii)GRF
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GIF多肽嵌合体；和b)所述一个或多个植物细胞相较于不包含所述引入的核酸分子或多肽的植物具有增加的再生效率，所述核酸分子编码GRF多肽和/或GIF多肽或GRF
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GIF嵌合体或所述多肽包含GRF多肽和/或GIF多肽或GRF
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GIF嵌合体：。2.如权利要求1所述的方法，还包括从所述一个或多个植物细胞产生植物。3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述GRF多肽选自小麦GRFGRF1、GRF2GRF2、GRF3、GRF4、GRF5、GRF6或GRF 9多肽或者来自其他植物物种的同源物或其组合。4.如权利要求1或2所述的方法，其中所述GIF多肽选自小麦GIF1、GIF2、GIF3多肽或者来自其他植物物种的同源物或其组合。5.如权利要求1或2所述的方法，其中所述GIF多肽选自SEQ ID NO:24
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30、43
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44、52、133
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135、139或者在SNH结构域中与其具有至少70％相同性的多肽序列或其组合。6.如权利要求1或2所述的方法，其在所述GRF多肽选自SEQ ID NO:9
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23、37
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39、51、125
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132或138或者在QLQ和WRC结构域中与其具有至少70％相同性的多肽序列或其组合。7.如权利要求1
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6中任一项所述的方法，其中所述GRF多肽包含选自SEQ ID NO:69
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83的QLQ和选自SEQ ID NO:84
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95的WRC结构域或与其具有至少70％相同性的序列。8.如权利要求1
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7中任一项所述的方法，其中所述GIF多肽包含选自SEQ ID NO:97
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103,136,137的SNH结构域或与其具有至少70％相同性的序列。9.如权利要求1
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8中任一项所述的方法，其中所述GRF多肽在miR396靶位点中包含一个或多个突变且降低所述植物中所述GRF多肽受miR396的阻遏。10.如权利要求9所述的方法，其中所述突变包含所述miR396靶位点的沉默突变。11.如权利要求9所述的方法，其中所述miRNA靶位点包含SEQ ID NO:53。12.如权利要求1
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11中任一项所述的方法，还包括可操作连接所述GRF、GIF或GRF
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GIF嵌合体的诱导...

【专利技术属性】
技术研发人员：J，
申请(专利权)人：国家科学技术研究委员会，
类型：发明
国别省市：