一种高细胞亲和性多糖-活性蛋白/多肽基活性水凝胶微球制备方法技术

本发明专利技术涉及一种高细胞亲和性多糖

【技术实现步骤摘要】
一种高细胞亲和性多糖
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活性蛋白/多肽基活性水凝胶微球制备方法


[0001]本专利技术属于组织填充和组织工程微载体材料领域，具体涉及一种具有高细胞亲和性多糖
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活性蛋白/多肽基活性水凝胶微球的制备及所得产品和应用。

技术介绍

[0002]随着社会经济的发展以及人们抗老意识的提高，人们对美容填充剂的需求逐渐增加。近年来，一定比例的微球分散在凝胶液基质中而得到的真皮填充剂受到广泛的关注，微球在体内逐渐被成纤维细胞包裹，同时刺激成纤维细胞分泌胶原蛋白，随后生成的胶原蛋白填充在微球缓慢降解而造成的空隙中。因为具有胶原刺激作用，微球分散液的填充效果维持时间较长。目前代表性的刺激胶原再生的聚合物微球有聚己内酯、羟基磷灰石、聚乙烯醇。
[0003]多糖是一种重要的生物活性成分，包括透明质酸(钠)、海藻酸(钠)、肝素(钠)、羧甲基几丁糖、羧甲基纤维素等。其中透明质酸(HA)又名玻尿酸，是现阶段最受欢迎的注射类美容填充剂，不仅具有优良的生物相容性、无免疫原性、生物可降解性等优点，还可对皮肤起着支撑、保水的作用。随着全球医美项目渗透率的提升，未来HA仍有很大的发展空间。然而多糖基材料，包括HA，不与蛋白质共价结合，大量研究表明HA基水凝胶及HA涂层不利于细胞和蛋白的粘附，但是细胞粘附会影响随后的细胞增殖和分化。为了提高多糖类材料的细胞亲和性，需要对其进行修饰。
[0004]Arg
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Gly
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Asp(RGD)是由精氨酸、甘氨酸和天门冬氨酸组成的三肽序列，源于纤维连接蛋白，存在于多种细胞外基质中。RGD能与细胞表面蛋白整合素特异性结合，是细胞粘附和迁移的重要识别位点。研究表明，将RGD引入到水凝胶结构中，能有效地促进细胞对生物材料的粘附。因此，含有RGD短肽序列的活性蛋白/多肽非常适于作为一种提高细胞亲和性的材料。
[0005]综上，以多糖高分子为基底，引入含有RGD短肽序列的活性蛋白/多肽的基材，不需要再额外接枝吸引细胞粘附分子，从而开发出一种主动引导细胞粘附、具有细胞亲和性的填充剂，为细胞的生长和迁移以及组织的进一步延伸提供力学支撑。上述制备工艺思路创新，原理上可行，有望用于组织填充和组织再生材料领域。

技术实现思路

[0006]针对多糖类材质的细胞亲和性不足问题，本专利技术提供了一种高细胞亲和性多糖
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活性蛋白/多肽基活性水凝胶微球及其制备方法。
[0007]本专利技术提供的一种高细胞亲和性多糖
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活性蛋白/多肽基活性水凝胶微球的制备方法，采用双组份体系，即带有多个羧基官能团的水溶性多糖和同时带有RGD肽段及两个及以上赖氨酸(氨基官能团)的水溶性蛋白或多肽链段，在缩合剂催化作用下，通过乳液法，两个组分体系在乳液体系中进行酰胺化共价交联形成水凝胶微球。
[0008]本专利技术的具体技术方案如下：
[0009](a)配制成胶缓冲液；
[0010](b)用成胶缓冲液溶解带有羧基的多糖，作为溶液(1)；
[0011](c)用成胶缓冲液溶解带有RGD肽段及分子表面含有多个伯氨基团的蛋白或多肽分子，作为溶液(2)；
[0012](d)将溶液(1)和溶液(2)混合后，根据所选缓冲液pH，选择缩合剂加入上述溶液中溶解并搅拌均匀得到成胶溶液(3)并开始反应；
[0013](e)将乳化剂加到油中并搅拌均匀作为油相；
[0014](f)在搅拌过程中，将成胶溶液(3)缓慢滴加到油相中，进行乳化并进行继续反应；
[0015](h)反应完成后，离心去除上清油相后，用含30％、50％、70％梯度乙醇水溶液进行离心洗涤，最后用PBS缓冲液多次抽滤洗涤。
[0016]通过上述方法制备的高细胞亲和性多糖
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活性蛋白/多肽基活性水凝胶微球，由生物相容性多糖和带有RGD活性成分的蛋白或多肽链段组成，其粒径可调，可具有支持细胞生长、刺激纤维细胞分泌胶原生成、促进正常组织生成等功能。
[0017]术语说明
[0018]粘附性多肽RGD：带有精氨酸
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甘氨酸
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天门冬氨酸序列的多肽，其多肽链段与整合素特异性结合，对细胞的粘附具有促进作用。
[0019]活性蛋白：活性蛋白是一种复杂的有机化合物。该化合物可以在体内发挥特定功能，例如促进细胞生长、增殖，维持细胞正常的生命活动。
[0020]细胞亲和性：细胞的亲和性是指细胞选择性地粘着的现象。
[0021]酰胺化反应：在缩合剂的作用下，羧基官能团与氨基官能团发生反应的过程。
[0022]缩合剂：缩合剂是指缩合反应中所加的反应辅助剂。一般有起催化作用的缩合剂和缩合时与所生成的分离原子或原子团结合的缩合剂。
[0023]乳液法：在乳化剂作用下，借助于机械搅拌，使反应单体溶液在油相中分散成乳状小液体后并进行持续反应。
[0024]本专利技术的优点：
[0025](1)本专利技术从材料组成出发，将同时带有RGD肽段及两个及以上赖氨酸(氨基官能团)的水溶性蛋白或多肽链段引入到带有多个羧基官能团的水溶性多糖中，其中RGD肽段提高了多糖微球的细胞亲和性，有利于细胞的初期粘附及后期的增殖和迁移。
[0026](2)除了具有RGD肽段，该活性蛋白还同时具有两个及以上赖氨酸(氨基官能团)，可直接充当水凝胶的交联剂，避免了化学交联剂的毒副作用，提高了微球的生物安全性。
[0027](3)通过粒径调控，该细胞亲和性的水凝胶微球具有刺激纤维细胞分泌胶原，促进正常组织生成等功能。
附图说明
[0028]图1实施例1中制备的凝胶球的表观尺寸；
[0029]图2实施例1中制备的凝胶球的粒径分布图；
[0030]图3实施例1制备的凝胶球表面种植的成纤维细胞(L929)，在明场下观察到的细胞形貌图；
[0031]图4在实施例1制备的凝胶球表面种植成纤维细胞(L929)，细胞的死活荧光染色图；
[0032]图5实施例5中制备的凝胶球的表观尺寸；
[0033]图6实施例5中制备的凝胶球的粒径分布图；
[0034]图7实施例5制备的凝胶球表面种植的成纤维细胞(L929)，在明场下观察到的细胞形貌图；
[0035]图8在实施例5制备的凝胶球表面种植成纤维细胞(L929)，细胞的死活荧光染色图；
具体实施方式
[0036]以下通过实施例对本专利技术特征及其它相关特征作进一步详细说明，以便于同行业技术人员的理解，但不以任何方式限制本专利技术。本
的技术人员，在本专利技术的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，都应属于本专利技术的保护范围。
[0037]实施例1：透明质酸
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溶菌酶水凝胶微球的制备
[0038]溶液1：准确称取0.12g透明质酸钠粉末(Mw＝40kDa)溶于2.5g磷酸盐缓冲液(pH＝7.2)中，搅拌均匀至澄清透明溶液。
[0039]溶液本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高细胞亲和性多糖
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活性蛋白/多肽基活性水凝胶微球制备方法，其特征在于，所述水凝胶微球包括：(1)任选多糖
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(C＝O)
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N
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蛋白质；(2)任选多糖
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(C＝O)
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N
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多肽；以及(3)成胶缓冲液；其中，所述任选多糖来源于糖重复单元中含有羧基官能团；所述蛋白质中含有RGD序列及同时具备两个及以上的赖氨酸结构单元(即活性伯氨基团)；所述多肽链上中含有RGD序列及同时具备两个及以上的赖氨酸结构单元。2.如权利要求1所述的一种高细胞亲和性多糖
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活性蛋白/多肽基活性水凝胶微球制备方法，其特征在于，所述多糖成分具有以下一个或多个特征：(a)多糖重复单元中含有羧基或者羧酸钠结构；(b)多糖在水中具有良好的溶解性，一般5％(wt/v)溶解后澄清透明，无明显颗粒或絮状物质。(b)重均分子量为6
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105Da以下；(c)纯度大于99％。3.如权利要求1所述的一种高细胞亲和性多糖
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活性蛋白/多肽基活性水凝胶微球制备方法，其特征在于，所述蛋白或者多肽具有以下一个或多个特征：(a)肽链结构中含有一个或多个精氨酸
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甘氨酸
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天门冬氨酸序列(RGD肽段)单元；(b)分子结构表面含有两个及以上赖氨酸结构；(c)纯度大于99％；(d)蛋白或多肽在水中具有良好的溶解性；一般5％(wt/v％)溶解后澄清透明，无明显颗粒或絮状物质。4.如权利要求1所述的一种高细胞亲和性多糖
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活性蛋白/多肽基活性水凝胶微球制备方法，其特征在于，所述多糖选自下组：透明质酸(钠)、海藻酸(钠)、肝素(钠)、羧甲基几丁糖、羧甲基纤维素或其组合，但不限于此。5.如权利要求1所述的一种高细胞亲和性多糖
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活性蛋白/多肽基活性水凝胶微球制备方法，其特征在于，所述活性蛋白/多肽选自下组：胶原蛋白、明胶蛋白、溶菌酶蛋白、柞蚕丝蛋白、含RGD人工合成多肽或其组合，但不限于此。6.如权利要求1所述的一种高细胞亲和性...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏长征，谈浩琪，郭家宏，余青青，蒋丽霞，
申请(专利权)人：上海其胜生物制剂有限公司，
类型：发明
国别省市：