一种糖肽富集聚合物材料及制备与应用制造技术

本发明专利技术涉及材料科学、分析化学和有机化学领域。本发明专利技术提供一种用于糖肽富集的聚合物材料的制备方法与应用。该糖肽富集材料包括基质及形成于基质表面的共聚物层。本发明专利技术是利用可逆加成

【技术实现步骤摘要】
一种糖肽富集聚合物材料及制备与应用


[0001]本专利技术涉及材料分析化学和有机化学领域，尤其涉及一种糖肽富集材料及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]蛋白质的糖基化修饰是生物体内最常见、最重要的蛋白翻译后修饰方式之一，因此糖蛋白组学研究引起了众多生物科学家的广泛关注。但是由于糖蛋白在生物体内绝对含量很低，目前进行糖蛋白组学研究的技术策略主要是在蛋白质或肽段水平上富集之后进行。已有的糖肽富集方法主要有：金属氧化物法，肼化学法，硼酸亲和法以及上述几种技术的联用。但是这些方法存在糖肽难以洗脱、非特异性吸附酸性肽链或者带碱性残基糖肽难以保留的问题，因此无法实现复杂生物样品大规模富集糖肽的目的。

技术实现思路

[0003]本专利技术为了解决上述技术问题提供一种对糖肽具有显著识别能力的糖肽富集材料及其制备方法与应用。该材料提供了一种具有高选择性、操作简单和重复性好的糖肽富集方法，能对生物样品中相对低含量的糖肽进行选择性富集。
[0004]本专利技术采用如下技术方案来实现：
[0005]一种共聚物修饰的基质材料，所述共聚物具有如下所示的分子结构：
[0006][0007]其中S为可逆加成
‑
断裂链转移自由基聚合反应所用的链转移试剂中的硫原子，R为苯基、烷基、酯基或胺基等，X为功能性单体。
[0008]上述方案中，所述的糖肽富集材料，其特征在于，所述功能性单体X为精氨酸、赖氨酸、色氨酸中的两种或几种，通过化学合成形成二肽/多肽功能性单体。
[0009]上述方案中，所述的糖肽富集材料，其特征在于，所述基质的材料为Si、Cu、Ag、Au、Pt、CuO、Fe3O4、多孔SiO2、多孔Al2O3、多孔TiO2、多孔ZrO2、琼脂糖凝胶或葡聚糖凝胶中的任意一种或者两种以上任意比例的混合。
[0010]上述方案中，所述的糖肽富集材料的制备方法，其特征在于，该制备方法是利用可逆加成
‑
断裂链转移自由基聚合反应机制，将功能性单体接枝到基质表面，具体制备方法如下：
[0011]1)在反应容器中依次加入功能性单体、基质材料、链转移试剂、引发剂，同时加入超纯水及甲醇的混合溶液作溶剂，其中，功能性单体/链转移试剂/引发剂的摩尔比为500：5：1，超纯水与甲醇的体积比为1:1
‑
10；
[0012]2)在无氧条件下，保持氮气气氛，在恒温60
‑
80℃条件下进行逆加成
‑
断裂链转移
自由基聚合反应24
‑
72小时；
[0013]3)反应结束后，洗涤基质表面并在50
‑
80℃下真空干燥，得到所述糖肽富集材料。
[0014]所述的糖肽富集材料在糖肽富集分离中的应用方法，其特征在于，采用柱固相萃取模式，具体步骤如下：
[0015]1)将糖肽富集材料装入移液枪枪头或者凝胶上样吸头中，形成微固相萃取柱，采用平衡液活化及平衡微固相萃取柱，将蛋白酶解物溶解于平衡液中，并上到微固相萃取柱上，糖肽富集材料与蛋白酶解物的质量比为100:1
‑
1000:1；
[0016]2)采用5
‑
200倍柱体积pH0
‑
7的淋洗液冲洗萃取柱；
[0017]3)采用5
‑
100倍柱体积pH1
‑
12的洗脱液洗脱得糖肽，上述整个过程在10
‑
60℃进行。
[0018]所述的糖肽富集材料在糖肽富集分离中的应用方法，其特征在于，采用分散固相萃取模式，具体步骤如下：
[0019]1)先采用活化液活化糖肽富集材料，将该糖肽富集材料与蛋白酶解物以质量比为100:1
‑
1000:1混合，孵化0.5分钟
‑
12小时，过滤或者分散固相萃取分离，弃上层清液，收集沉淀；
[0020]2)采用pH＝0
‑
7的淋洗液对沉淀清洗；
[0021]3)将清洗后的沉淀采用体积pH＝1
‑
12溶液洗脱，过滤或者分散固相萃取分离，收集上层清液，得糖肽，上述整个过程在10
‑
60℃进行。
[0022]所述的方法，其特征在于，所述活化液和平衡液均为有机溶剂、有机酸和水的混合液，所用到的有机溶剂为乙腈、甲醇或乙醇，有机酸为甲酸、乙酸或三氟乙酸，有机溶剂的体积浓度为10％
‑
95％，有机酸的体积浓度为0.1
‑
5％，碱性溶剂的体积浓度为0.1
‑
10％。
[0023]所述的方法，其特征在于，所述活化液和平衡液均为有机溶剂、有机酸和水的混合液，有机溶剂为乙腈、甲醇或乙醇，有机酸为甲酸、乙酸或三氟乙酸，有机溶剂的体积浓度为10％
‑
95％，有机酸的体积浓度为0.1
‑
5％，碱性溶剂的体积浓度为0.1
‑
10％。
[0024]所述的方法，其特征在于，所述平衡液中有机溶剂体积浓度为50
‑
95％，pH＝0
‑
7。
[0025]所述的方法，其特征在于，所述洗脱液中碱性溶剂体积浓度为0.1
‑
10％，pH＝7
‑
12。
[0026]所述的方法，其特征在于，所述洗脱液中酸性溶剂体积浓度为0.1
‑
5％，pH＝1
‑
7。
[0027]本专利技术的有益效果为：
[0028]1、本专利技术制备的糖肽富集材料在分离富集糖肽时表现出了高选择性和高通量等特点，可以实现复杂样品中糖肽的高选择性富集；
[0029]2、本专利技术制备的糖肽富集材料既可以方便的装填成不同长度，不同内径的柱子，又可以直接添加于离心管，操作简单，易于重复。特别适合微量生物样品中糖肽段的分离富集；
[0030]3、本专利技术富集得到的糖肽可直接用于电喷雾
‑
质谱分析(ESI
‑
MS)或者基质辅助激光解吸电离
‑
飞行时间质谱(MALDI
‑
TOF MS)，提高了质谱的检测限和灵敏度。
[0031]本专利技术开发了一系列基于二肽/多肽功能性单体的共聚物修饰基质材料，并通过可逆加成
‑
断裂链转移自由基聚合反应的方法分别将单体接枝到各种材料上，获得的修饰材料形貌均匀、聚合物层可控，进而表现为选择性的可控性。将聚合物修饰的多孔材料与柱
固相萃取模式或分散固相萃取模式有机的结合，可实现复杂混合物中糖肽高选择性、高重复性和高通量地富集，可显著提高糖蛋白鉴定数目。因此，其有望在糖肽富集，进而大规模分离糖蛋白等方面获得广泛的应用。
附图说明
[0032]图1为为精氨酸、色氨酸构成二肽的单体结构示意图。
[0033]图2为共聚物合成路线示意图。
[0034]图3为精氨酸、色氨酸本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种糖肽富集聚合物材料，为共聚物修饰的聚合物材料，其特征在于，所述的共聚物修饰材料具有如下所示的分子结构：其中S为可逆加成
‑
断裂链转移自由基聚合反应所用的链转移试剂中的硫原子，R为苯基、C1
‑
C20烷基、酯基或
‑
NH2胺基等，X为功能性单体；n＝3
‑
20。2.如权利要求1所述的糖肽富集材料，其特征在于，所述功能性单体X为连接了丙烯酸的Trp
‑
Arg或者Trp
‑
Lys，其中丙烯酸连接在色氨酸吲哚环的氨基上。3.如权利要求1所述的糖肽富集材料，其特征在于，所述基质的材料为无孔硅胶、多孔硅胶、硅片、琼脂糖凝胶或葡聚糖凝胶中的任意一种或者两种以上任意比例的混合；键合量在1
‑
10mmol/g基质。4.如权利要求1
‑
3任一所述的糖肽富集材料的制备方法，其特征在于，该制备方法是利用可逆加成
‑
断裂链转移自由基聚合反应机制，将功能性单体接枝到基质表面，具体制备方法如下：1)在反应容器中依次加入500mmol功能性单体、基质材料、5mmol链转移试剂、1mmol引发剂，同时加入水及甲醇的混合溶液作溶剂，其中，功能性单体/链转移试剂/引发剂的摩尔比为500：5：1，水与甲醇的体积比为1:1
‑
1:10；功能性单体可以是连接了丙烯酸的Trp
‑
Arg或者Trp
‑
Lys中一种或两种；基质材料可以是无孔硅胶、多孔硅胶、硅片、琼脂糖凝胶或葡聚糖凝胶中的任意一种或者两种以上任意比例的混合物；链转移试剂可以是4
‑
氰基戊酸二硫代苯甲酸，2
‑
氰基
‑2‑
丙基
‑
十二烷基三硫代碳酸盐，2
–
十二烷基(十二烷基硫基硫代羰基硫基)2
‑
甲基丙酸、氰甲基
‑
十二烷基三硫代碳酸盐，4
‑
氰基
‑4‑
(苯基硫代甲酰硫基)戊酸中的任意一种或两种以上；引发剂可以是偶氮二异丁脒盐酸盐或偶氮二异丁腈中的任意一种或两种；2)在无氧条件下，保持氮气气氛，在恒温60
‑
80℃条件下进行逆加成
‑
断裂链转移自由基聚合反应24
‑
72小时；3)反应结束后，洗涤基质表面并在50
‑
80℃下真空干燥，得到所述糖肽富集材料。5.如权利要求1
‑
3任一所述的糖肽富集材料在糖肽富集分离中的应用，其特征在于，采用柱固相萃取模式，具体步骤如下：1)将糖肽富集材料装入移液枪枪头或者凝胶上样吸头中，形成微固相萃取柱，采用乙腈、甲醇、乙醇、水、甲酸、乙酸、三氟乙酸等溶剂构成的混合液作为平衡液活化及平衡微固相萃取柱，将蛋白酶解物溶解于平...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁鑫淼，李秀玲，董雪芳，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：