光学显微镜和使用光学显微镜记录图像的方法技术

一种使用光学显微镜记录图像的方法，包括以下步骤：将照明光(12)引导至样本(35)；将来自样本(35)的检测光(15)引导到多个光子计数传感器元件(61)，每个光子计数传感器元件依次记录多个光子计数(x)；从光子计数(x)形成(S3)多个待分析的光子计数分布(81

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】光学显微镜和使用光学显微镜记录图像的方法


[0001]本公开涉及一种根据权利要求1所述的使用光学显微镜记录图像的方法以及根据权利要求19所述的光学显微镜。

技术介绍

[0002]荧光标记的使用正在增加，特别是对于生物样本。较高的照明强度将有助于提供高速的图像数据记录。然而，由于样本可能会被光照损坏，因此照明强度不应太高。
[0003]除此之外，由于这些原因，采用了特别敏感的传感器元件。具有多碱性阴极的光电倍增管(PMT)经常让位于具有GaAsP阴极的PMT，这有助于在可见光谱范围内实现更高的量子效率。然而，此处采用的放大过程的乘法性质将噪声(所谓的放大噪声或过量噪声)引入到测量信号中。因此，净灵敏度低于指定的量子效率。
[0004]为了消除倍增噪声，可以将放大倍数增加到可以计算由单个光子触发的单个脉冲的程度。例如，为此目的使用了能够进行时间相关单光子计数(TCSPC)的电子设备。测量的信号是纯数字的，测量的强度值可以对应于撞击在光电阴极上的光子数量，被量子效率降低。然而，电子设备具有例如几十纳秒的停滞时间，在此期间不可能记录入射光子。
[0005]由于停滞时间，在传感器的照明密度过高的情况下，信号可能会失真。特别是，传感器元件上的高照明强度会导致测量值过低(所谓的堆积效应)。因此，尽管使用光子计数的测量可能非常敏感，但要在图像数据中达到一定的信噪比(SNR)需要相对较长的时间。这个问题可以通过并行光子计数来缓解，其中信号的检测PSF(点扩展函数)分布在多个光子计数传感器元件的阵列上，即排列上。由此，光子以分布式方式统计地撞击大量传感器元件。这增加了当光子撞击时大多数传感器元件处于活动状态并且只有少数传感器元件处于在记录前一个光子被后的停滞时间的概率。
[0006]用光学显微镜记录图像的通用方法至少包括以下步骤：将照明光引导至样本；以及将来自样本的检测光引导至多个光子计数传感器元件，每个光子计数传感器元件依次记录多个光子计数。
[0007]因此，通用光学显微镜包括用于向样本发射照明光的光源以及用于记录来自样本的检测光的多个光子计数传感器元件。光子计数传感器元件分别被配置为依次记录多个光子计数。
[0008]即使在原则上可以为不同的传感器元件单独设置灵敏度时，传感器元件的过载在这方面仍然存在问题，例如在US9,997,551B2中所描述的。特别是当用户增加照明功率以实现最佳图像质量时，传感器元件阵列也会出现图像信息失真的不利饱和。在低照明强度下，虽然增加每个样本点的曝光时间可以提高图像质量，但它也会导致更长的测量时间，并且随着时间的推移观察过程是不可取的。

技术实现思路

[0009]可以认为本专利技术的一个目的是提供一种光学显微镜和一种利用光学显微镜通过
光子计数传感器元件记录图像的方法，其中检测图像记录中的误差并且，如果合适的话进行补偿。
[0010]该目的通过具有权利要求1的特征的方法以及通过具有权利要求19的特征的光学显微镜来实现。
[0011]根据本专利技术的光学显微镜和根据本专利技术的方法的有利变体是从属权利要求的目的并且也在以下描述中说明。
[0012]在上述类型的方法中，根据本专利技术，至少执行以下步骤：
[0013]‑
形成待分析的多个光子计数分布以及从光子计数中形成至少一个参考光子计数分布；
[0014]‑
计算待分析的每个光子计数分布与参考光子计数分布之间的相似度；以及
[0015]‑
根据计算出的待分析的相应光子计数分布的相似性，将传感器元件识别为过载。
[0016]根据本专利技术的上述类型的光学显微镜包括控制单元，其被配置为：
[0017]‑
形成待分析的多个光子计数分布以及从光子计数中形成至少一个参考光子计数分布；
[0018]‑
计算待分析的每个光子计数分布与参考光子计数分布之间的相似性；以及
[0019]‑
根据计算出的相应待分析的光子计数分布的相似性，将传感器元件识别为过载。
[0020]本专利技术的不同实施例利用多个传感器元件测量非常相似的图像内容但接收不同量级的光强度的事实。一个易于理解的示例是所谓的Airyscan(也称为图像扫描显微镜)，其中一个样本点被照亮，并且该样本点被成像到多个传感器元件的阵列上。检测PSF在多个传感器元件上延伸，使得它们的测量值基本上来自相同的样本点。然而，检测PSF在传感器元件上不具有恒定值，而是可以，例如，在传感器元件的横向上呈现高斯曲线的形式。因此，中心传感器元件接收比外部传感器元件更多的光并且测量比外部传感器元件更高的光子计数。现在可以用一束照明光扫描样本，同时传感器元件测量每个照明样本点的光子计数。可以将传感器元件的光子计数聚合成光子计数分布，从而例如针对每个传感器元件形成光子计数分布。光子计数分布基本上来自相同的图像内容，但在光子计数的量级/数量方面有所不同，主要是由于检测PSF的形式。特别是在光子计数分布的光子计数的不同量级补偿/标准化的重新缩放之后，光子计数分布因此应当基本上彼此对应。如果传感器元件在测量过程中被过载(饱和)，则其最高光子计数过低。因此，可以在光子计数分布的比较中检测传感器元件是否在光子计数的记录期间被过载，并因此对应于失真的图像信息。如果传感器元件被识别为过载，则可以可选地以自动化方式实施合适的措施，例如过载光子计数的数学校正或具有适当修改的显微镜设置的新图像记录，如稍后更详细描述的。
[0021]光子计数分布的形成
[0022]为了比较光子计数分布，至少一个光子计数分布被用作参考光子计数分布。对于参考光子计数分布，已知或假设在记录光子计数期间未发生饱和，稍后将更详细地解释。剩余的光子计数分布称为待分析的光子计数分布。
[0023]光子计数分布可以由恰好一个的光子计数或由多个传感器元件的光子计数形成。因此，光子计数分布的数量，即待分析的光子计数分布和参考光子计数分布的数量可以小于、等于或原则上也大于传感器元件的数量。特别地，可以形成传感器元件组(“分箱”)，其中一组传感器元件的光子计数被聚合并且一起形成光子计数分布。至少一个参考光子计数
分布也可以这样形成；或者，可以通过聚合多个光子计数分布来计算参考光子计数分布。
[0024]确定参考光子计数分布
[0025]参考光子计数分布应由一个或多个在进行测量期间未饱和/过载的传感器元件的光子计数形成。这种选择可以以多种方式发生。
[0026]例如，可以选择至少一个光子计数分布用作参考光子计数分布，其中该选择根据相应光子计数分布的光子计数量级发生。通过考虑光子计数的量级，可以确保参考光子计数分布由一个或多个未被过载的传感器元件的光子计数形成。除了使用选定的光子计数分布作为参考光子计数分布之外，还可以通过聚合(例如，通过求和、平均或标准化以及随后的求和或平均)从选定的光子计数分布中计算单个参考光子计数分布。
[0027]将传感器元件的光子计数用于参考光子计数分布的先决条件可本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种使用光学显微镜记录图像的方法，包括将照明光(12)引导至样本(35)；将检测光(15)从样本(35)引导至多个光子计数传感器元件(61)，其中每个光子计数传感器元件(61)连续记录多个光子计数(x)；其特征在于形成(S3)多个待分析的光子计数分布(81
‑
83)以及来自光子计数(x)的至少一个参考光子计数分布(80)；计算每个待分析的光子计数分布(81
‑
83)和参考光子计数分布(80)之间的相似性；以及根据计算出的相应的光子计数分布或待分析的光子计数分布(81
‑
83)的相似性，将传感器元件(61)识别为过载。2.根据前述权利要求的方法，其特征在于计算每个待分析的光子计数分布(81
‑
83)和参考光子计数分布(80)之间的重新缩放；其中计算每个待分析的光子计数分布和参考光子计数分布之间的相似性考虑各自的重新缩放。3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于根据待分析的光子计数分布(81
‑
83)形成直方图和/或根据参考光子计数分布(80)形成参考光子计数分布。4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于选择至少一个光子计数分布作为参考光子计数分布(80)或用于形成所述参考光子计数分布(80)，其中该选择根据相应光子计数分布的光子计数(x)的量级而发生。5.根据前述权利要求所述的方法，其特征在于选择至少一个光子计数分布作为参考光子计数分布(80)或用于形成所述参考光子计数分布(80)的先决条件是该光子计数分布的最高光子计数(x)或由该光子计数分布的最高光子计数(x)形成的平均值低于预定上限，其中该上限特别地是属于该光子计数分布的传感器元件(61)的最大计数率乘以曝光时间的1％和30％之间。6.根据前述两项权利要求之一的方法，其特征在于选择至少一个光子计数分布作为参考光子计数分布(80)或用于形成所述参考光子计数分布(80)的先决条件是根据该光子计数分布的光子计数(x)确定的信号量级测量值超过预定的最小值。7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于根据相应传感器元件(61)或相应传感器元件(61)的位置，选择至少一个光子计数分布以用作参考光子计数分布(80)。
8.根据权利要求2至7中任一项所述的方法，其特征在于通过拉伸或压缩所述待分析的光子计数分布(81
‑
83)或参考光子计数分布来计算各个待分析的光子计数分布(81
‑
83)和参考光子计数分布(80)之间的重新缩放(80)。9.根据权利要求2至8中任一项所述的方法，其特征在于重新调整至少包括以下内容：将拟合函数(90
‑
93)调整至参考光子计数分布(80)和各个待分析的光子计数分布(81
‑
83)以确定拟合参数，根据确定的拟合参数拉伸或压缩每个待分析的光子计数分布(81
‑
83)或参考光子计数分布(80)。10.根据权利要求2至9中任一项所述的方法，其特征在于相似度的计算至少包括以下步骤：计算任一待分析的光子计数分布(81
‑
83)与参考光子计数分布(80)在重新缩放后之间的相关系数，在计算出的相关系数低于预定最小值的情况下，相应的待分析的光子计数分布(81
‑
83)被识别为过载。11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于用照明光(12)扫描样本(35)，相邻传感器元件(61...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒂莫，
申请(专利权)人：卡尔蔡司显微镜有限责任公司，
类型：发明
国别省市：