一种少量细胞脂质组学分析方法技术

本发明专利技术公开了一种针对少量细胞(15

【技术实现步骤摘要】
一种少量细胞脂质组学分析方法


[0001]本专利技术涉及分析化学领域，是一种针对少量细胞采用微探针取样
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多通道芯片纳喷
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高分辨质谱技术的高灵敏、高通量脂质组学分析方法。

技术介绍

[0002]代谢组学是系统研究生命体受内在基因突变、病理生理改变或外在环境刺激作用时，体内多元动态的代谢物应答。细胞是生命体结构与功能的基本单位，以细胞为对象的代谢组学研究，有助于揭示生命活动的过程和规律。传统的细胞代谢组学研究为了增加细胞提取物中可量化代谢物的数量，通常使用大量细胞(如数百万个细胞)进行代谢组学分析。然而，减少代谢组学所需的细胞数量将有利于许多研究，如干细胞、循环肿瘤细胞和从组织获得的原代细胞数目稀少、很难获得；另一方面，如少量细胞的代谢组学研究可行，则不需要培养很多细胞，既可节约人力和物力，缩短试验周期，从而大大降低实验成本，同时也使得细胞生物学研究更为便捷。因此，开发针对少量细胞的代谢组学分析方法具有重要意义。
[0003]少量细胞代谢组学分析的挑战在于代谢物的高灵敏和高通量检测。液相色谱
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质谱联用(LC
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MS)技术因具有灵敏度高、特异性强、多样化等特性，已成为当前代谢组学分析研究的主流技术。然而，质谱检测前的LC色谱分离往往较为耗时，难以实现高通量分析。此外，常规的电喷雾电离源(ESI)通常存在较强的基质干扰和离子抑制作用，无法满足少量细胞代谢物分析的灵敏度需求。另一方面，现已报道的少量细胞代谢组学研究中少量细胞的获取仍需从常量细胞稀释计数得到，非常不利于难以大规模培养的稀有细胞的研究，且其细胞裂解、代谢物提取等繁琐耗时的样品前处理步骤，不仅会造成样品的损失，也限制了分析通量的提高。
[0004]针对当前少量细胞代谢组学研究存在的难题，本专利技术中采用了微探针精准取样15
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25个细胞，在孔板中直接加入喷雾溶剂进行脂质提取，无需复杂的样品前处理，避免了样品损失；直接进样的纳升电喷雾电离源在降低基质效应、提高检测灵敏度的同时，又具有很高的分析通量；采用的高分辨质谱拼接式分段扫描模式不仅能显著提升检测灵敏度，还能保持较高的质量精度，大大提高了代谢物定性的准确性。

技术实现思路

[0005]本专利技术为了实现少量细胞代谢组学分析，建立了基于微探针取样
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多通道芯片纳喷
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高分辨质谱技术的高灵敏、高通量分析方法。该方法具有细胞取样精准、无需样品前处理、兼具高灵敏和高通量等优点。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：
[0007](1)使用拉针仪(P
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1000，Sutter Instrument,Novato,U.S.A.)拉制毛细管微探针并固定在与三维微移动操作平台相连的移动滑轨上，借助显微镜将毛细管微探针精准移动至目标细胞的上方，在负压作用下吸取15
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25个动物细胞，取样过程耗时0.4
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0.6min；
[0008](2)将吸取的15
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25个动物细胞经注射泵注入96
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384孔板中，并加入10
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20μL喷雾
溶剂进行脂质提取，其在正离子模式下的组成为氯仿：甲醇：异丙醇(1:2:4，v/v/v)，5mM甲酸铵和0.2％甲酸作为修饰剂；负离子模式下组成为氯仿：甲醇：异丙醇(2:3:5，v/v/v)，5mM乙酸铵作为修饰剂；两者皆含有12种脂质内标，包括LPC 12:0、PC(15:0/15:0)、PE(15:0/15:0)、PG(15:0/15:0)、PA(17:0/17:0)、PS(16:0/16:0
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d62)、Cer(d18:1/17:0)、SM(d18:1/12:0)、TG(15:0/15:0/15:0)、DG(12:0/12:0)、ChoE 17:0、FFA 18:0
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d3，内标物浓度为0.01
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0.05μg/ml。上述混合溶液在0
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4℃静置0.5
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1min，完成脂质提取；
[0009](3)上述脂质提取样品经多通道芯片纳喷离子源的自动进样器直接进入高分辨质谱进行分析，采用拼接式分段扫描模式采集一级质谱信息。操作条件如下：
[0010]①
多通道芯片纳喷离子源条件：D型芯片(喷嘴内径4.1μm)；正离子模式下的喷雾电压为+1.5kV，负离子模式下的喷雾电压为
‑
1.8kV；气压为0.6psi；进样室温度为4℃；进样体积为5μL；
[0011]②
高分辨组合型四级杆
‑
轨道阱质谱条件：离子传输管温度为275℃；正离子模式下的一级m/z拼接式分段扫描窗口设置为290
‑
390、380
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480、470
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570、560
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610、600
‑
650、640
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690、680
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730、720
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770、760
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810、800
‑
850、840
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940、930
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1030、1020
‑
1120、1110
‑
1210、1200
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1300Da，负离子模式下则分别设置为150
‑
250、240
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340、330
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430、420
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520、510
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610、600
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650、640
‑
690、680
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730、720
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770、760
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810、800
‑
850、840
‑
940、930
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1030、1020
‑
1120、1110
‑
1210、1200
‑
1300Da；微扫描设为3；分辨率为240K；注射时间设为200ms；动态增益控制为1e6，采集时间为0.6min；
[0012](4)对(1
‑
3)过程进行6
‑
10次重复；采用Xcalibur软件导出一级质谱数据，对数据进行峰匹配，得到包含m/z和峰强度的特征离子总峰表。扣除溶剂空白、信噪比小于10及在6
‑
10次重复中出现频率低于80％的特征离子后，得到稳定存在的特征离子列表，将其与Lipid Maps数据库中的精确m/z进行匹配，质量精度设为
±
3ppm，得到可定性的脂质列表；
[0013](5)向常量细胞(1
×
106‑5×
106)培养皿中加入1...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种少量细胞脂质组学分析方法，是基于微探针取样
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多通道芯片纳喷
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高分辨质谱技术的少量细胞脂质组学高灵敏、高通量分析方法，其特征在于：(1)借助三维微移动操作平台，在显微镜下使用毛细管微探针，在负压作用下吸取15
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25个少量细胞；(2)将15
‑
25个少量细胞经注射泵注入96
‑
384孔板中，并加入10
‑
20μL喷雾溶剂，在0
‑
4℃下静置0.5
‑
1min，进行脂质提取；(3)置于孔板中的脂质提取样品经多通道芯片纳喷离子源(Advion NanoMate)的自动进样器直接进入高分辨质谱进行分析，采用拼接式分段扫描模式对一级质谱信息进行采集；对上述过程进行6
‑
10次重复，并分别对数据进行峰匹配，得到包含质荷比(m/z)和峰强度的特征离子总峰表；扣除溶剂空白、信噪比小于10及在6
‑
10次重复中出现频率低于80％的特征离子后，得到稳定存在的特征离子列表，再将样品中的一级m/z和Lipid Maps数据库中的精确m/z进行匹配，设置质量精度为
±
3ppm，得到15
‑
25个少量细胞中可定性的脂质列表。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，建立常量细胞脂质数据库并验证上述细胞脂质定性的可靠性：常量细胞(1
×
106‑5×
106)中加入1
‑
2mL脂质提取溶剂，震荡、静置、离心取上清后直接进入高分辨质谱进行分析，采用拼接式分段扫描模式采集一级质谱信息，并对样品进行6
‑
10次重复分析；对数据进行峰匹配，得到包含质荷比(m/z)和峰强度的特征离子总峰表；扣除溶剂空白、信噪比小于10及在6
‑
10次重复中出现频率低于80％的特征离子后，得到稳定存在的特征离子列表，将其与Lipid Maps数据库中的精确m/z进行匹配，质量精度设为
±
3ppm，将匹配后的m/z峰表作为一级m/z列表进行平行反应监测模式(PRM)的二级质谱采集，由此获得常量细胞的脂质数据库，其中包括m/z和/或MS/MS碎片信息；若少量细胞定性脂质可回溯至常量细胞脂质数据库，则认为仅依托少量细胞一级m/z匹配Lipid Maps数据库中精确m/z的定性方法可靠，后续研究则无需培养常量细胞进行验证。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中使用拉针仪(P
‑
1000，Sutter Instrument,Novato,U.S.A.)拉制毛细管微探针并固定在与三维微移动操作平台相连的移动滑轨上，借助显微镜将毛细管微探针精准移动至目标细胞的上方，在负压作用下吸取15
‑
25个动物细胞，取样过程耗时0.4
‑
0.6min。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中将吸取的15
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25个动物细胞经注射泵注入孔板中，并加入10
‑
20μL喷雾溶剂进行脂质提取，其在正离子模式的组成为氯仿：甲醇：异丙醇(1:2:4，v/v/v)，其中5mM甲酸铵和0.2％甲酸作为修饰剂；负离子模式下其组成为氯仿：甲醇：异丙醇(2:3:5，v/v/v)，其中5mM乙酸铵作为修饰剂；正负离子模式下的喷雾溶剂中皆含有12种脂质内标，包括溶血磷脂酰胆碱(LPC)12:0、磷脂酰胆碱(PC)15:0/15:0、磷脂酰乙醇胺(PE)15:0/15:0、磷脂酰甘油(PG)15:0/15:0、甘油磷脂酸(PA)17:0/17:0、磷脂酰丝氨酸(PS)16:0/16:0
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d62、神经酰胺(Cer)d18:1/17:0、鞘磷脂(SM)d18:1/12:0、甘油二酯(DG)12:0/12:0、甘油三酯(TG)15:0/15:0/15:0、胆固醇酯(ChoE)17:0、游离脂肪酸(FFA)18:0
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d3，内标浓度范围为0.01
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0.05μg/ml；上述混合溶液在0
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4℃下静置0.5
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1min，完成脂质提取。5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中脂质提取样品经多通道芯片
纳喷离子源的自动进样器直接进入高分辨质谱进行分析，采用拼接式分段扫描模式采集一级质谱信息；多通道芯片纳喷离子源
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高分辨质谱的操作条件如下：(1)多通道芯片纳喷离子源条件：D型芯片(喷嘴内径4.1μm)；正离子模式的喷雾电压为+1.5kV，负离子模式的喷雾电压为
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1.8kV；气压为0.6psi；进样室温度为4℃；样品体积为5μL；(2)高分辨组合型四级杆
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轨道阱质谱(Thermo Scientific，Q Exactive
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HF)条件：离子传输管温度为275℃；正离子模式下的一级m/z拼接式分段扫描窗口分别设置为290
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390、380
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480、470
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570、560
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610、600
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【专利技术属性】
技术研发人员：许国旺，徐天润，胡春秀，李杭，丰迪生，秦望舒，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：