一种受光调控的蛋白酶工具及其配套底物制造技术

本发明专利技术属于分子生物学技术领域，具体提供了一种受光调控的蛋白酶工具及其配套底物。所述蛋白酶工具包括HIV

【技术实现步骤摘要】
一种受光调控的蛋白酶工具及其配套底物


[0001]本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种受光调控的蛋白酶工具及其配套底物。

技术介绍

[0002]通过合成生物学手段对细胞内信号通路进行人工干预，实现对细胞行为的人工控制具有重要的临床诊断治疗价值。蛋白酶具有通过水解肽键从而改变蛋白质底物状态的功能，包括使水解后的蛋白质底物失去原有活性和移除底物中原有的抑制性结构域而使蛋白质底物具有下游活性。因此蛋白酶可以在干预细胞内信号转导的过程中被应用为一种有效的分子工具。为了实现对蛋白酶的水解活性进行人为控制，对蛋白酶进行工程化改造是一种比较常用的技术手段。目前通用的策略是将完整的蛋白酶拆分裂为两个结构域，再将两个蛋白酶结构域分别与可诱导的异源二聚结构域以柔性方式连接。目前已经发表的六种分裂式可诱导蛋白酶分别由下列蛋白酶改造而来：烟草蚀纹病毒蛋白酶(TEVp)、芜菁花叶病毒蛋白酶(TUMVp)、烟草脉斑驳病毒蛋白酶(TVMVp)、向日葵轻度花叶病毒蛋白酶(SuMMVp)、大豆花叶病毒蛋白酶(SbMVp)和李痘病毒蛋白酶(PPVp)。人工信号输入细胞诱导异源二聚结构域二聚，进而使分裂的蛋白酶结构域重新聚合成为有活性的完整蛋白酶结构，恢复蛋白酶的水解活性，从而开启下游的信号过程。上述的病毒蛋白酶均为内切酶，具有准确的氨基酸识别切割序列。在蛋白酶目标底物中引入相对应的蛋白酶识别切割序列构成人工蛋白酶底物，与其相对应的蛋白酶配套使用以实现特定的胞内信号控制效果。
[0003]现有可响应人工信号调控的蛋白酶工具都是基于“分裂蛋白”的技术路线实现的。这意味着这些可调控蛋白酶工具都必须以异源二聚的形式进行激活。在构建这样的蛋白酶工具的过程中，需要分别对分裂后的两部分蛋白酶结构域进行构建和优化，在后续的使用中，需要同时将异源的两部分蛋白酶元件同时转染进哺乳动物细胞中。因此现有的可调控蛋白酶技术手段具有一定局限性：一是分裂后的蛋白酶一定为异源二聚的形式限制了一些高效的同源二聚蛋白结构域被应用到蛋白酶工具的构建中；二是每构建一种蛋白酶工具都需要同时构建、优化以及转染两部分蛋白质结构域，增加了构建过程的工作量和在病毒转染载体上占据的有效包装容量。
[0004]基于这一情况，本专利技术使用基于突变天然同源二聚蛋白酶的技术路线开发了可受人工调控的同源二聚型蛋白酶工具，同时开发了一系列可与该新型蛋白酶配套使用的蛋白酶底物，以在细胞中实现不同的调控功能。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是克服现有可调控蛋白酶技术手段具有一定局限性的问题。
[0006]为此，本专利技术提供了一种受光调控的蛋白酶工具，所述蛋白酶工具包括HIV
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1蛋白酶突变体和Vivid蛋白；所述Vivid蛋白通过柔性肽段与所述HIV
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1蛋白酶突变体进行连接；所述HIV
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1蛋白酶突变体通过对天然条件下介导HIV
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1蛋白酶二聚的氨基酸位点进行突变
获得。该蛋白酶受波长为450nm的蓝光照射诱导后二聚激活。
[0007]进一步的，为了在减弱天然HIV
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1蛋白酶同源二聚活性的同时，又能保证突变体蛋白酶可以在所连接的光诱导二聚结构域所介导的二聚下重新恢复催化活性，上述HIV
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1蛋白酶突变体为T96A突变体或N98D突变体；其中，所述T96A突变体为将HIV
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1蛋白酶第96位的苏氨酸突变为丙氨酸的突变体；所述N98D突变体为将HIV
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1蛋白酶第98位的天冬酰胺突变为天冬氨酸的突变体。
[0008]进一步的，由于天然Vivid蛋白的同源二聚亲和力较低，直接以Vivid蛋白进行光调控蛋白酶工具的构建不能获得很好的蛋白酶激活效果，因此需要进一步对光调控蛋白酶工具中的Vivid蛋白结构域进行突变筛选。优选使用第52位异亮氨酸突变为半胱氨酸的Vivid蛋白I52C突变体作为构建光调控蛋白酶工具的蓝光响应同源二聚结构域。
[0009]进一步的，上述柔性肽段的氨基酸序列为SGGGSGGGSGGG。
[0010]进一步的，上述Vivid蛋白突变体连接在HIV
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1蛋白酶突变体最C端时，蛋白酶工具表现出较好的诱导后活性，因此Vivid蛋白突变体优选通过柔性肽段连接在所述HIV
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1蛋白酶突变体的C端。
[0011]为了实现蛋白酶工具对细胞内信号过程的控制，本专利技术还提供了一种上述蛋白酶工具的配套底物，所述配套底物包括从N端到C端依次连接的Ub(R)
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dK降解标签、蛋白酶工具识别切割位点、目标效应蛋白、蛋白酶工具识别切割位点和4个串联的PEST基序。
[0012]本专利技术还提供了一种上述蛋白酶工具的配套底物，所述配套底物包括底物蛋白，在所述底物蛋白的天然蛋白酶识别切割位点中插入蛋白酶工具识别切割位点；所述底物蛋白为天然受蛋白酶水解后激活的蛋白。
[0013]本专利技术还提供了一种上述蛋白酶工具的配套底物，所述配套底物包括从N端到C端依次连接的目标效应蛋白、蛋白酶工具识别切割位点和CAAX序列；其中所述CAAX序列为来自RAS2蛋白C端末尾的CAAX氨基酸基序。
[0014]具体的，由于HIV
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1蛋白酶具有多种不同的识别切割位点，为了实现蛋白酶对底物更高的水解效率，本专利技术中对底物构建过程中使用的HIV
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1蛋白酶识别序列进行了优化测试，选用了最优的识别切割位点，上述蛋白酶工具识别切割位点的氨基酸序列为VSFNFPQITL。
[0015]具体的，上述目标效应蛋白为荧光蛋白、具有下游转录调控活性的转录因子或对细胞内源信号转导通路具有干扰作用的蛋白激酶中的一种。
[0016]具体的，上述底物蛋白为Caspase3蛋白或Gasdermin D蛋白。
[0017]与现有技术相比，本专利技术具有以下优点和有益效果：
[0018]本专利技术提供的这种受光调控的蛋白酶工具将可受人工信号调控的蛋白酶工具由异源二聚形式改变为同源二聚形式，因此在进行细胞实验时所需转入细胞的蛋白酶工具元件数目由两个减少为一个，蛋白酶工具的氨基酸序列长度也有所缩短。以目前最常用的基于烟草蚀纹病毒蛋白酶(TEVp)所开发的异源二聚蛋白酶工具作为比较，完整光诱导型TEVp蛋白酶工具由两部分构成，分别为与FKBP蛋白连接的N端部分TEV蛋白酶和与Frb蛋白连接的C端部分TEV蛋白酶，这两部分蛋白的氨基酸数目分别为244个氨基酸和230个氨基酸，因此要完整使用TEV蛋白酶工具一共需要转染两部分，共474个氨基酸大小的蛋白。而本专利技术中所构建的同源二聚蛋白酶工具使用时仅需转染一个结构域，光调控型蛋白酶工具的大小
仅为262个氨基酸。更精简的结构和更小的蛋白质大小使该蛋白酶工具在被使用时占据更小的载体可用包装容量，在一些需要向细胞内转染多种蛋白元件的复杂人工信号通路构建工作中本专利技术提供的蛋白酶工具将更具优势。本专利技术提供的蛋白酶工具本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种受光调控的蛋白酶工具，其特征在于：所述蛋白酶工具包括HIV
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1蛋白酶突变体和Vivid蛋白；所述Vivid蛋白通过柔性肽段与所述HIV
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1蛋白酶突变体进行连接；所述HIV
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1蛋白酶突变体通过对天然条件下介导HIV
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1蛋白酶二聚的氨基酸位点进行突变获得。2.如权利要求1所述的受光调控的蛋白酶工具，其特征在于：所述HIV
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1蛋白酶突变体为T96A突变体或N98D突变体；其中，所述T96A突变体为将HIV
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1蛋白酶第96位的苏氨酸突变为丙氨酸的突变体；所述N98D突变体为将HIV
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1蛋白酶第98位的天冬酰胺突变为天冬氨酸的突变体。3.如权利要求1所述的受光调控的蛋白酶工具，其特征在于：所述Vivid蛋白为Vivid蛋白I52C突变体；所述Vivid蛋白I52C突变体为将Vivid蛋白第52位异亮氨酸突变为半胱氨酸的突变体。4.如权利要求1所述的受化学调控的蛋白酶工具，其特征在于：所述Vivid蛋白结构域通过柔性肽段连接在所述HIV
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1蛋白酶突变体的C端。5.如权利要求1所述的受光调控的蛋白酶工具，其特征在于：所述柔性肽段的氨基酸序列为SGGGSGGGSGGG。6.一种如权利要求1<...

【专利技术属性】
技术研发人员：傅偲，魏平，范盈盈，鞠见齐，
申请(专利权)人：中国科学院深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：