药物偶联的位点特异性定量制造技术

一种使用蛋白酶辅助药物解偶联、连接子标记和质谱分析对抗体

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】药物偶联的位点特异性定量
专利

[0001]本专利技术一般涉及使用蛋白酶辅助药物解偶联和质谱分析对抗体
‑
药物偶联物的药物偶联进行位点特异性定量或表征的方法。

技术介绍

[0002]抗体
‑
药物偶联物(ADC)包括具有生物活性药物附着物(通过连接子连接)的抗体，例如，药物有效载荷。因为抗体可以与靶细胞的特异性位点结合，从而将生物活性药物有效递送到靶细胞，所以ADC的开发是提高药物疗效的一种策略。使用ADC将化疗药物递送到靶向癌细胞已取得明显改善。
[0003]由于抗体的多价性质以及氨基酸与连接分子之间的非特异性亲电反应，ADC的制备可能具有挑战性。ADC的一般分布特征包括ADC、非偶联抗体和非偶联药物有效载荷的混合物。由于非偶联抗体与药物偶联抗体竞争靶抗原，因此在存在非偶联抗体的情况下，可递送到靶细胞的药物量会减少。通常，衍生ADC是包含各种ADC的高度异质种类，其药物抗体比(DAR)可变并且偶联位点繁杂，包括偶联的偶联位点和非偶联的偶联位点。由于存在不理想的ADC种类，ADC的异质性会对药物的安全性和疗效产生重大影响。理想的ADC制剂应包括明确的DAR和同质性程度。对DAR可变的ADC的位点特异性药物偶联进行定量和表征，例如药物偶联的位点特异性定量，是控制ADC制剂质量属性的关键过程，这可能直接影响ADC的疗效。
[0004]已经使用了质谱(MS)、液相色谱质谱联用(LC
‑
MS)和成像毛细管等电聚焦(iCIEF)对ADC混合物进行表征(Wagh等人，mAbs，10:2，222
‑
243，2018，抗体
‑
药物偶联物分析表征的挑战与新前沿)。然而，由于ADC异质性的复杂性，在对ADC进行表征时，药物结合的位点特异性定量存在巨大挑战。
[0005]可以理解的是，需要对ADC进行表征确保DAR明确以及与药物安全性和疗效相关的同质性程度(特别是对于ADC药物偶联物的位点特异性定量和/或表征)的方法。

技术实现思路

[0006]本专利技术提供了一种对抗体
‑
药物偶联物的药物偶联进行位点特异性量化和/或表征的方法，其中，偶联包括与样本中部分偶联肽或蛋白的特异性偶联位点连接的附着物。由于DAR的广泛差异和抗体上的附着位置控制不良，用于药物
‑
抗体偶联的连接化学反应可能存在一些问题。由此产生的ADC可能是包含各种ADC的高度异质混合物。量化不同位点的位点特异性药物偶联仍然是个挑战，理想的ADC制剂应包括明确的DAR和同质性程度。
[0007]本专利技术提供了一种对与样本中部分偶联肽或蛋白至少一个特异性偶联位点连接的至少一个附着物偶联进行量化或表征的方法，包括以下步骤：对部分所述至少一个附着物进行裂解，产生含有裂解连接子的肽或蛋白，其中，所述附着物包含裂解连接子；在所述部分偶联肽或蛋白的非偶联偶联位点增加修饰连接子；以及对样本进行质量分析，识别含有所述裂解连接子和/或所述修饰连接子的肽或蛋白。在某些方面，使用木瓜蛋白酶、组织蛋白酶B或纤溶酶对所述部分附着物进行裂解。
[0008]在某些方面，在本专利技术的所述方法中，所述至少一个附着物包含一个连接子和一个有效载荷，其中，所述附着物的裂解部分包含所述有效载荷，其中，所述连接子包含所述裂解连接子。在某些方面，本专利技术所述方法进一步包括根据对裂解连接子和修饰连接子的量化，对所述附着物的位点特异性偶联进行量化或表征。在某些方面，在本专利技术的所述方法中，使用质谱仪、电喷雾电离质谱仪、纳升电喷雾电离质谱仪或三重四极杆质谱仪进行所述质量分析，其中，所述质谱仪可与液相色谱系统连接，其中，所述质谱仪能够进行LC
‑
MS(液相色谱
‑
质谱法)、LC
‑
MRM
‑
MS(液相色谱
‑
多反应监测
‑
质谱法)或LC
‑
MS/MS分析。
[0009]在某些方面，本专利技术所述方法进一步包括在对所述部分附着物进行裂解之前和/或在非偶联偶联位点增加修饰连接子之前，用酶处理肽或蛋白。在某些方面，本专利技术所述方法进一步包括在对所述样本进行质量分析之前，用酶处理样本。在某些方面，使用酶、蛋白酶、化学物质、酸、碱或还原剂对所述部分附着物进行裂解。在某些方面，在对所述部分附着物裂解步骤之前，在非偶联偶联位点增加修饰连接子。在某些方面，在增加修饰连接子步骤和对样本进行质量分析步骤之前，对部分附着物进行裂解。在某些方面，所述修饰连接子的分子量与裂解连接子的分子量不同。
[0010]在某些方面，本专利技术所述方法进一步包括在对所述部分附着物进行裂解之前和/或在非偶联偶联位点增加修饰连接子之前，用酶处理肽或蛋白，其中，所述酶为胰蛋白酶。在某些方面，本专利技术所述方法进一步包括在对所述样本进行质量分析之前，用酶处理样本，其中，所述酶为Glu
‑
C。在某些方面，所述特异性偶联位点或非偶联偶联位点位于肽或蛋白的半胱氨酸残基内。在某些方面，所述附着物通过马来酰亚胺附着基团与所述至少一个特异性偶联位点连接。在某些方面，所述肽或蛋白是一种抗体、抗体片段、抗体Fab区、抗体Fc区或融合蛋白。
[0011]在某些方面，所述连接子是一种酸敏连接子、蛋白酶可裂解连接子、含二硫化物连接子、焦磷酸酯连接子或腙连接子。在某些方面，所述连接子包含肽，其中包括缬氨酸
‑
丙氨酸、苯基丙氨酸
‑
赖氨酸、缬氨酸
‑
瓜氨酸或其衍生物。在某些方面，所述连接子进一步包含对氨基苄氧基羰基(PABC)或对氨基苯甲醇(PABA)。
[0012]在其他方面，所述修饰连接子包含聚乙二醇。在某些方面，通过马来酰亚胺附着基团将所述修饰连接子增加至非偶联偶联位点。
[0013]在其他方面，所述有效载荷是一种药物、化合物、毒素、细胞毒素剂、抗有丝分裂剂、微管抑制剂、DNA损伤剂、拓扑异构酶抑制剂、RNA聚合酶抑制剂、鹅膏蕈碱类似物、微管溶素类似物、化疗药物、微管阻聚剂或微管促聚剂。
[0014]在某些方面，所述部分偶联肽或蛋白选自含有式I中偶联肽或蛋白的基团，
[0015][0016]其中，R为连接子，X为有效载荷。在某些方面，所述连接子包含聚乙二醇，并且所述有效载荷是一种药物、化合物、毒素、细胞毒素剂、抗有丝分裂剂、微管抑制剂、DNA损伤剂、拓扑异构酶抑制剂、RNA聚合酶抑制剂、鹅膏蕈碱类似物、微管溶素类似物、化疗药物、微管阻聚剂或微管促聚剂。
[0017]在某些方面，所述部分偶联肽或蛋白选自含有式II中偶联肽或蛋白的基团，
[0018][0019]其中，R1为间隔子，R2为
–
H或
–
CH3，R3为
–
CH3或
–
(CH2)3NHC(O)NH2，X为有效载荷。在某些方面，所述间隔子包含聚乙二醇，并且所述有效载荷是一种药物、化合物、毒素、细胞毒素本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种对与样本中部分偶联肽或蛋白至少一个特异性偶联位点连接的至少一个附着物偶联进行量化或表征的方法，包括以下步骤：对部分所述至少一个附着物进行裂解，产生含有裂解连接子的肽或蛋白，其中，所述附着物包含裂解连接子；在所述部分偶联肽或蛋白的非偶联偶联位点增加修饰连接子；对样本进行质量分析，识别含有所述裂解连接子和/或所述修饰连接子的肽或蛋白。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述至少一个附着物包含一个连接子和一个有效载荷，其中，所述附着物的裂解部分包含所述有效载荷，其中，所述连接子包含所述裂解连接子。3.根据权利要求1所述的方法，进一步包括根据对裂解连接子和修饰连接子的量化，对附着物的位点特异性偶联进行量化或表征。4.根据权利要求1所述的方法，其中，使用质谱仪、电喷雾电离质谱仪、纳升电喷雾电离质谱仪或三重四极杆质谱仪进行所述质量分析，其中，所述质谱仪可与液相色谱系统连接，其中，所述质谱仪能够进行LC
‑
MS(液相色谱
‑
质谱法)、LC
‑
MRM
‑
MS(液相色谱
‑
多反应监测
‑
质谱法)或LC
‑
MS/MS分析。5.根据权利要求1所述的方法，进一步包括在对所述部分附着物进行裂解之前和/或在非偶联偶联位点增加修饰连接子之前，用酶处理所述肽或蛋白。6.根据权利要求1所述的方法，进一步包括在对所述样本进行质量分析之前，用酶处理样本。7.根据权利要求1所述的方法，其中，使用酶、蛋白酶、化学物质、酸、碱或还原剂对所述部分附着物进行裂解。8.根据权利要求1所述的方法，其中，在对所述部分附着物裂解步骤之前，在非偶联偶联位点增加所述修饰连接子。9.根据权利要求1所述的方法，其中，在增加修饰连接子步骤和对样本进行质量分析步骤之前，对部分附着物进行裂解。10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述修饰连接子的分子量与裂解连接子的分子量不同。11.根据权利要求5所述的方法，其中，所述酶为胰蛋白酶。12.根据权利要求1所述的方法，其中，使用木瓜蛋白酶、组织蛋白酶B或纤溶酶对所述部分附着物进行裂解。13.根据权利要求6所述的方法，其中，所述酶为Glu
‑
C。14.根据权利要求1所述的方法，其中，所述特异性偶联位点或非偶联偶联位点位于肽或蛋白的半胱氨酸残基内。15.根据权利要求1所述的方法，其中，所述附着物通过马来酰亚胺附着基团与所述至少一个特异性偶联位点连接。16.根据权利要求1所述的方法，其中，所述肽或蛋白是一种抗体、抗体片段、抗体Fab区、抗体Fc区或融合蛋白。17.根据权利要求2所述的方法，其中，所述连接子是一种酸敏连接子、蛋白酶可裂解连接子、含二硫化物连接子、焦磷酸酯连接子或腙连接子。
18.根据权利要求2所述的方法，其中，所述连接子包含肽。19.根据权利要求2所述的方法，其中，所述连接子包含缬氨酸
‑
丙氨酸、苯基丙氨酸
‑
赖氨酸、缬氨酸
‑
瓜氨酸或其衍生物。20.根据权利要求2所述的方法，其中，所述连接子包含聚乙二醇。21.根据权利要求2所述的方法，其中，所述连接子包含对氨基苄氧基羰基(PABC)或对氨基苯甲醇(PABA)。22.根据权利要求1所述的方法，其中，所述修饰连接子包含聚乙二醇。23.根据权利要求1所述的方法，其中，通过马来酰亚胺附着基团将所述修饰连接子增加至非偶联偶联位点。24.根据权利要求2所述的方法，其中，所述有效载荷是一种药物、化合物、毒素、细胞毒素剂、抗有丝分裂剂、微管抑制剂、DNA损伤剂、拓扑异构酶抑制剂、RNA聚合酶抑制剂、鹅膏蕈碱类似物、微管溶素类似物、化疗药物、微管阻聚剂或微管促聚剂。25.根据权利要求1所述的方法，其中，所述部分偶联肽或蛋白选自含有式I中偶联肽或蛋白的基团，其中，R为连接子，X为有效载荷。26.根据权利要求25所述的方法，其中，所述连接子包含聚乙二醇，其中，所述有效载荷是一种药物、化合物、毒素、细胞毒素剂、抗有丝分裂剂、微管...

【专利技术属性】
技术研发人员：X，
申请(专利权)人：瑞泽恩制药公司，
类型：发明
国别省市：