RibAS、RibBS、RibGS和RibHS基因水稻中提高VB2含量应用及方法技术

RibAS、RibBS、RibGS和RibHS基因在水稻种子中提高VB2含量的应用及方法，将枯草杆菌中的RibA、RibB、RibG和RibH基因序列分别进行优化，获得RibAS、RibBS、RibGS和RibHS四个基因序列，之后分别与水稻胚乳特异储存蛋白GluB

【技术实现步骤摘要】
RibAS、RibBS、RibGS和RibHS基因水稻中提高VB2含量应用及方法


[0001]本专利技术属于农作物基因工程领域，具体涉及RibAS、RibBS、RibGS和RibHS基因在水稻种子中提高VB2含量的应用及方法。

技术介绍

[0002]维生素B2(VB2)是生物体内生化反应中多种酶的组成部分，可促进脂肪、蛋白质、碳水化合物和核酸的代谢，VB2具有维护皮肤和粘膜的生理功能，它是生命活动不可缺少的维生素。身体长期、严重缺乏VB2是导致癌症、肿瘤的根本原因；各种消化道溃疡、出血、肿块、息肉、肝硬化也都是因为缺乏VB2引起的；痔疮也是因为缺乏VB2引起的。女性的宫颈糜烂也是因为缺乏VB2引起的；通常所说的“上火”就是VB2短期、急剧缺乏症，及时、足量补充VB2，上述这些症状都会减轻直到痊愈。植物中，VB2主要存在于谷物的皮、壳当中，在谷物加工过程中约有50％都流失了。
[0003]稻米的蛋白和活性营养成分主要存在于种皮和胚中，而日常使用的精米则是去掉种皮和胚的胚乳(主要成分是淀粉)，其营养价值大大下降。因此通过基因工程在胚乳中增加强化合成特定的营养成分和功能性物质，是功能性水稻育种的主要目标。如在胚乳中产生胡萝卜素的“黄金大米”，以及以胚乳作为生物反应器生产具有生物活性的“人血清蛋白米”等。由于现代人的饮食结构导致了人体无法从食物中获取足够的VB2，所以大多数人都处于缺乏VB2的状态。因此，如何让食物中的VB2含量得到提高也是现在研究的重点与难点。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供RibAS、RibBS、RibGS和RibHS基因在水稻种子中提高VB2含量的应用及方法，本专利技术将RibAS、RibBS、RibGS和RibHS基因组合应用于水稻种子中，并使其完全表达，从而获得富含VB2的水稻新品种，其胚乳中的维生素含量与野生型水稻种子相比，提高了大约3.5倍，使其在经过精加工获得的精米中仍保留有足够的VB2。既可以直接用于食用，也可以作为生产VB2的原材料种子，对于新型功能性作物育种具有重要的指导意义和生产应用价值，另外，本专利技术所获得的VB2含量显著提高的水稻新品种还可以作为原始材料从而获得多种维生素含量提高的水稻新种质。
[0005]为了达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0006]RibAS、RibBS、RibGS和RibHS基因在水稻种子中提高VB2含量的应用，其特征在于，所述RibAS基因的具体核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述RibBS基因的具体核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述RibGS基因的具体核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述RibHS基因的具体核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0007]进一步，所述RibAS、RibBS、RibGS和RibHS基因分别由枯草杆菌中的RibA、RibB、RibG和RibH基因优化得到。
[0008]进一步，所述RibAS、RibBS、RibGS和RibHS四基因在水稻种子中的表达顺序为
RibAS
‑
RibBS
‑
RibGS
‑
RibHS。
[0009]利用如权利要求1或2或3所述的RibAS、RibBS、RibGS和RibHS基因提高水稻种子中VB2含量的方法，包括以下步骤：
[0010]1)将根据水稻的密码子偏好性对枯草杆菌中的RibA、RibB、RibG和RibH基因序列进行优化，获得RibAS、RibBS、RibGS和RibHS四个基因序列，所述RibAS基因的具体核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述RibBS基因的具体核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述RibGS基因的具体核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述RibHS基因的具体核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
[0011]2)将RibAS、RibBS、RibGS和RibHS四个基因分别与水稻胚乳特异储存蛋白GluB
‑
1基因启动子和终止子融合，分别构建基因表达盒；
[0012]3)将步骤2)获得的4个基因表达盒元件分别连接入植物表达载体，获得含RibAS、RibBS、RibGS和RibHS四基因表达盒的植物多基因转化载体；
[0013]4)将步骤3)中获得的植物多基因转化载体转入农杆菌，转化至水稻愈伤组织，获得胚乳中VB2含量提高的水稻。
[0014]优选的，步骤2)中，所述水稻胚乳特异性储存蛋白GluB
‑
1基因启动子序列如SEQ ID NO.5所示；水稻胚乳特异性储存蛋白GluB
‑
1基因终止子序列如SEQ ID NO.6所示。
[0015]优选地，步骤3)中，所述植物表达载体为pCAMBIA1301。
[0016]优选的，步骤4)中，所述水稻为水稻中花11。
[0017]本专利技术将枯草杆菌中的RibA基因、RibB基因、RibG基因和RibH基因分别进行优化，优化后的基因称为RibAS基因、RibBS基因、RibGS基因和RibHS基因，再转化至水稻，使得4基因按照RibAS
‑
RibBS
‑
RibGS
‑
RibHS顺序进行表达，获得水稻新品种。该水稻新品种的胚乳中VB2含量，与野生型水稻种子相比，提高了大约3.5倍。
[0018]经过研究发现在枯草杆菌中RibA基因、RibB基因、RibG基因和RibH基因是核黄素合成代谢途径中的必须基因，核黄素操纵子(rib)表达水平是影响核黄素生物合成的关键因素，所以本专利技术选择来源于枯草杆菌的RibA、RibB、RibG和RibH进行优化合成，获得优化后的RibAS基因、RibBS基因、RibGS基因和RibHS基因，使其能够在水稻种子中完整表达，以提高水稻种子胚乳中VB2含量。
[0019]本专利技术通过优化四种基因，优化原则为：
[0020]一、优化基因密码子，按照水稻密码子偏爱，提高基因翻译效率；
[0021]二、消除基因内部的常用限制性内切酶的识别位点，便于表达盒构建；
[0022]三、消除逆向重复序列、茎环结构和转录终止信号，使基因内部的GC/AT均衡，提高RNA的稳定性，其中基因内部的GC/AT的比例尽量达到1：1；
[0023]四、使基因编码蛋白符合N端原则，以提高翻译蛋白的稳定性；
[0024]五、优化mRNA二级结构自由能，以提高基因表达效率。在优化二级结构时避免6个或更多的连续的A+T序列，避免5个或更多的G+C序列；避免2、3位用CG和TA双寡核苷酸；同时尽可能使基因5
’
端的自由能ΔG提高达到
‑
5.4Kcal以上，使3
’
端的自由能降低达到
‑
10.8Kcal以下。
[0025]通过上述优化原则使优化后的基因能够同时在水稻种子胚乳中进行表达，提高基因的表达效率本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.RibAS、RibBS、RibGS和RibHS基因在水稻种子中提高VB2含量的应用，其特征在于，所述RibAS基因的具体核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述RibBS基因的具体核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述RibGS基因的具体核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述RibHS基因的具体核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。2.如权利要求1所述的多基因组合在提高水稻种子胚乳VB2含量中的应用，其特征在于，所述RibAS、RibBS、RibGS和RibHS基因分别由枯草杆菌中的RibA、RibB、RibG和RibH基因优化得到。3.如权利要求1或2所述的多基因组合在提高水稻种子胚乳VB2含量中的应用，其特征在于，所述RibAS、RibBS、RibGS和RibHS四基因在水稻种子中的表达顺序为RibAS
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RibBS
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RibGS
‑
RibHS。4.利用如权利要求1或2或3所述的RibAS、RibBS、RibGS和RibHS基因提高水稻种子中VB2含量的方法，包括以下步骤：1)将根据水稻的密码子偏好性对枯草杆菌中的RibA、RibB、RibG和RibH基因序列进行优化，获得RibAS、RibBS、RibGS和RibHS四个基因序列，所述RibAS基因的具体核苷酸序列如SE...

【专利技术属性】
技术研发人员：田永生，许晶，姚泉洪，彭日荷，高建杰，王波，李振军，付晓燕，张福建，邓永东，张文慧，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：