一种细胞穿膜肽-目的蛋白复合物的制备及其高效导入链霉菌活细胞的方法技术

本发明专利技术公开了一种细胞穿膜肽

【技术实现步骤摘要】
一种细胞穿膜肽
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目的蛋白复合物的制备及其高效导入链霉菌活细胞的方法


[0001]本专利技术涉及微生物
，具体涉及一种细胞穿膜肽
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目的蛋白复合物的制备及其高效导入链霉菌活细胞的方法。

技术介绍

[0002]细胞穿膜肽（Cell penetrating peptide，CPP）是一类由约5至30个氨基酸组成的短肽，其可以作为活细胞物质载运系统，通过共价或非共价偶连的方式携带目的蛋白、核酸、纳米材料等穿透动物细胞的生理屏障细胞膜，并在一定浓度内对细胞活性产生影响较小。目前，CPP已较为广泛地应用于以胞内分子为靶标的非侵入性药物递送工具。近年来的研究表明，CPP不仅能携带寡核苷酸、小干扰RNA、质粒、纳米材料等克服动物细胞细胞膜，而且能将小干扰RNA或质粒等载运至含有细胞壁结构的高等植物、藻类和微生物细胞中，但相关报道尚较为少见。
[0003]目前已有的穿膜肽介导“货物”向微生物活细胞转运的相关研究，多集中在穿膜肽可增加微生物细胞对抗菌活性物质，如抗菌肽、肽核酸和功能化光动力抗菌纳米粒子的摄取，从而本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种细胞穿膜肽
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目的蛋白复合物的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)构建出CPP
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mCherry蛋白表达质粒pET28a
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CPP
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mCherry：将穿膜肽、4个甘氨酸连接肽、荧光蛋白mCherry融合表达基因构建于大肠杆菌表达质粒pET
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28a(+)中；(2)将质粒pET28a
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CPP
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mCherry用氯化钙化学转化法转化入大肠杆菌E.coliBL21(DE3)感受态细胞中；(3)将CPP
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mCherry重组表达菌株接种于含卡那霉素的5mL LB液体培养基中，37℃，220rpm活化8h，将活化菌株以1:100的体积比接种于250mL 2
×
YT培养基中，加入250μL浓度50
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55mg/mL的卡那霉素后培养4.5
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5.5h，待OD
600
值达到0.6～0.8，将菌液降温至16℃后添加IPTG，于16℃、220rpm诱导表达16～20h；(4)CPP
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mCherry融合蛋白纯化及浓缩：将诱导表达的菌液离心后收集菌体，在菌体中加入30mL PBS溶液，将菌体剥离下来后于涡旋仪上彻底重悬，将重悬菌体超声破碎，然后将破碎后的菌液离心、收集上清；钴亲和层析柱经PBS平衡3
‑
5个柱体积后，将收集的上清过柱，并重复挂柱一次；用PBS洗3
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5个柱体积，用添加含5mM咪唑的PBS洗3
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5个柱体积，用含150mM咪唑的PBS洗5
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8个柱体积，收集所有洗脱液；用含500mM咪唑的PBS洗3
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5个柱体积，将收集的蛋白透析、浓缩，得到细胞穿膜肽
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目的蛋白重组融合蛋白。2.根据权利要求1所述的一种细胞穿膜肽
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目的蛋白复合物的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的穿膜肽及其氨基酸序列为下列一种：Tat：YGRKKRRQRRR；ANTP：RQIKIWFQNRRMKWKK；KFF3K：KFFKFFKFFK；R9：RRRRRRRRR；K9：KKKKKKKKK；KH9‑
BP100：KHKHKHKHKHKHKHKHKHKKLFKKILKYL；步骤(4)对应得到的细胞穿膜肽
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目的蛋白复合物为Tat
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mCherry、ANTP
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mCherry、(KFF)3K
‑
mCherry、R9‑
mCher...

【专利技术属性】
技术研发人员：张怀东，李芹，黄建忠，何柳，郭丽君，郭兴，罗鑫格，
申请(专利权)人：福建师范大学，
类型：发明
国别省市：