一种携带新型冠状病毒S-RBD基因的重组卡介苗菌株制造技术

本发明专利技术公开了一种携带hCoV

【技术实现步骤摘要】
一种携带新型冠状病毒S
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RBD基因的重组卡介苗菌株


[0001]本专利技术涉及生物制剂
，具体说是新型冠状病毒疫苗制备领域。

技术介绍

[0002][0003]得益于学科技术的发展和进步，特异性疫苗的研发时间大幅缩减，整体呈现快速高效的局势。但仍有几点值得进一步探究。首先，现有的新冠疫苗注射进入人体后，主要激活B细胞产生抗体，引发免疫反应，进而对人体形成保护。但目前尚不清楚这种保护作用能持续多久，抗体数量可能会随着时间推移而下降，保护力逐渐减弱。其次，病毒的突变性需要更广谱的抗新冠病毒疫苗来应对变异病毒株。Delta变异病毒株的出现使得新冠的传染力和传播力大大提高，各国报道的疫苗保护率都出现不同程度地下降，甚至完全接种现有疫苗的人也有机会再次感染Delta新冠病毒。已有研究报告称冠状病毒变体带34个突变，其中包括可能引起“免疫逃逸”的变异株。这些突变可能会增加感染者体内的病毒浓度、延长感染时间并增加传播能力。这意味着，由免疫系统产生的特异性抗体可能对病毒变异株抵抗力较弱。虽然目前的疫苗暂时可以对抗新的变种，但是效果如何仍是未知数。再者，针对60 岁以上、18岁以下以及高风险人群新冠疫苗接种的安全性和有效率仍待考究，新冠疫苗的使用具有一定局限性。
[0004]流行病学研究显示，相较于普遍实施卡介苗(BCG)疫苗接种政策的地区，没有BCG接种政策的地区有着较高的新冠患病率及死亡率。有报告称BCG可能具有预防新冠的作用。此外，BCG常被用于构建表达不同水平的病毒、细菌或寄生虫病原体抗原载体的研究。例如，表达 HIV免疫原的重组BCG菌株有效激活小鼠细胞因子和T细胞应答，表现出作为抗HIV
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1/TB整合疫苗或作为其他病毒载体疫苗的强大潜力。除了表达HIV抗原，多项研究发现表达其他不同种抗原的重组BCG菌株，包括伯氏疏螺旋体、肺炎链球菌、利什曼原虫和疟原虫等，同样也能够诱导针对相应病原体攻击的保护作用。
[0005]CN113403330A公开了一种改造后的新冠病毒S基因及利用其构建的重组质粒和重组卡介苗及应用。具体的，通过对S基因启动子区域部分序列与终止子区域部分序列进行改造，获得改造后的S蛋白基因全序列(6882bp)，使其能够在大肠杆菌
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结核杆菌穿梭质粒pMVS261中顺利表达，得到重组质粒pMVS；并通过电转化将重组质粒pMVS导入BCG，得到重组的BCG(rBCG)，用于新冠疫苗的制备。
[0006]然而，S全长蛋白分子量大的性质，决定了其不利于在原核系统的稳定表达，而S
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RBD蛋白是S蛋白最核心的抗原区域，其序列较短，在原核系统中能够稳定表达，并且可以激发同等效价的免疫反应。选择 S
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RBD作为抗原还具有ADE风险较低、产生有效抗体产量高等潜在优势。
[0007]因此，开发出一种包含新型冠状病毒S
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RBD抗原的重组卡介苗存在着巨大的市场空间，目前国内市场尚没有相应疫苗出现。

技术实现思路

[0008]针对现有新冠疫苗存在的保护作用持续时长不足、保护面不广、 保护人群不全等问题，本专利技术提供了一种携带优化后的hCoV
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19 S
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RBD表达基因的重组卡介苗菌株。本专利技术以pMV261、pMV361作为 携带原核表达优化的S
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RBD基因的载体，转化Mycobacterium bovisBCG str.Pasteur 1173P2菌株获得重组的BCG，能够通过新冠病毒 基因片段S
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RBD诱发的特异性免疫，通过BCG诱发的非特异性免疫， 两种免疫反应共同作用提高人群对新冠病毒的防御作用。
[0009]本专利技术为实现上述目的，通过以下技术方案实现：
[0010]本专利技术第一方面提供了一种新冠病毒SARS
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CoV
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2重组卡介苗菌株，其中所述菌株包含S
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RBD蛋白表达基因。
[0011]在优选的实施方式中，所述S
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RBD蛋白包含序列为SEQ ID NO：1 所示的氨基酸序列。
[0012]在优选的实施方式中，所述S
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RBD蛋白包含与SEQ ID NO：1具有 80％同一性的氨基酸序列；进一步优选地，所述同一性为85％，90％， 95％，96％，97％，95％，99％。
[0013]在优选的实施方式中，所述S
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RBD蛋白表达基因选自包含序列为 SEQ ID NO：2所示的核酸序列、包含序列为SEQ ID NO：3所示的核酸序列，包含与SEQ ID NO：2具有80％同一性的核苷酸序列或者包含与 SEQ ID NO：3具有80％同一性的核苷酸序列。
[0014]在优选的实施方式中，所述S
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RBD蛋白表达基因选自包含与 SEQ ID NO：2具有85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％同一性的核苷酸序列或者包含与SEQ ID NO：3具有85％，90％，95％，96％，97％， 98％，99％同一性的核苷酸序列。
[0015]在优选的实施方式中，所述序列为SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3 的S
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RBD蛋白表达基因通过游离型载体或整合型载体转化进入卡介苗菌株。优选地，所述游离型载体为pMV261质粒，所述整合型载体为
[0016]在优选的实施方式中，所述卡介苗菌株为Mycobacterium bovis BCGstr.Pasteur 1173P2菌株。
[0017]在优选的实施方式中，所述S
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RBD蛋白基因通过无缝克隆方式插入载体。
[0018]本专利技术的第二方面提供了本专利技术第一方面的重组卡介苗菌株在 SARS
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CoV
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2疫苗制备中的应用。
[0019]本专利技术的第三方面提供了一种新冠病毒SARS
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CoV
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2重组卡介 苗菌株的制备方法，所述包括如下步骤：1)采用无缝克隆方法，以hCoV
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19的基因组为模板，PCR扩增获得S
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RBD蛋白表达基因；2) 对获得的基因序列做原核表达优化，优化后的基因表达的S
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RBD蛋白 氨基酸序列不变；3)将优化后S
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RBD蛋白表达基因片段与线性化的 pMV261、pMV361质粒连接；4)挑选正确克隆，转化卡介苗菌株。
[0020]在优选的实施方式中，采用无缝克隆方法。
[0021]在优选的实施方式中，用于S
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RBD蛋白基因扩增的模板为 hCoV
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19。
[0022]在优选的实施方式中，用于S
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RBD蛋白基因扩增的引物为S
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RBDFP 和S
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种新型冠状病毒SARS－CoV－2重组卡介苗菌株，其特征在于，所述菌株包含S－RBD蛋白表达基因。2.根据权利要求1所述的重组卡介苗菌株，其特征在于，所述S－RBD蛋白包含序列为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；所述S－RBD蛋白表达基因选自包含序列为SEQ ID NO：2所示的核酸序列、包含序列为SEQ ID NO：3所示的核酸序列，包含与SEQ ID NO：2具有90％同一性的核苷酸序列或者包含与SEQ ID NO：3具有90％同一性的核苷酸序列。3.根据权利要求1或2所述的重组卡介苗菌株，其特征在于，所述S－RBD蛋白表达基因通过游离型载体或整合型载体转化进入卡介苗菌株。4.根据权利要求3所述的重组卡介苗菌株，其特征在于，所述游离型载体为pMV261质粒，所述整合型载体为pMV361质粒。5.根据权利要求1或2所述的重组卡介苗菌株，其特征在于，所述卡介苗菌株为Mycobacterium bovis BCG str.Pasteur 1173P2菌株。6.根据权利要求1－5任一项所述的重组卡介苗菌株，其特征在于，所述S－RBD蛋白基因通过无缝克隆方式插入载体。7....

【专利技术属性】
技术研发人员：冯国栋，黄温勉，薛晓畅，刘韬，汪昕，
申请(专利权)人：复旦大学附属中山医院，
类型：发明
国别省市：