检测毛霉菌病病原体的试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了一种检测毛霉菌病病原体的试剂盒及方法。该试剂盒包括毛霉菌病病原体寡核苷酸探针，毛霉菌病病原体寡核苷酸探针包括以下探针中的至少一种：毛霉菌病病原体寡核苷酸探针1；毛霉菌病病原体寡核苷酸探针2；毛霉菌病病原体寡核苷酸探针3；毛霉菌病病原体寡核苷酸探针4；毛霉菌病病原体寡核苷酸探针5；或毛霉菌病病原体寡核苷酸探针6。本申请结合主要针对于引起毛霉菌6个属和1个种的18s rDNA序列设计通用引物，以及针对于以上种属设计各自的特异性探针，该引物探针组合适配于PCR仪平台，可以在保证检测的特异性和灵敏度的基础上出检测结果。的基础上出检测结果。的基础上出检测结果。

【技术实现步骤摘要】
检测毛霉菌病病原体的试剂盒及方法


[0001]本专利技术涉及生物医药
，具体而言，涉及一种检测毛霉菌病病原体的试剂盒及方 法。

技术介绍

[0002]毛霉菌病(mucormycosis)是一种侵袭性真菌病，以前称为接合菌病，是由毛霉菌目真菌 引起的危害较大的感染性疾病。其特征为菌丝侵犯血管，引起血栓形成及坏死，产生鼻、脑、 消化道及呼吸道等处病变，预后严重。“毛霉菌病”可能造成眼、鼻发红疼痛，并伴有发烧、头 疼、咳嗽、呼吸急促等症状，严重情况下还可能造成上颌骨受损甚至失明。毛霉菌病是一种 严重但罕见的真菌感染，可能导致病人失明或其他严重问题，致死率高达50％。对免疫力低 下的人群(比如糖尿病、癌症、器官移植、艾滋病以及长期应用细胞毒类药物与皮质类固醇 等患者)致死率甚至达到80％。
[0003]作为机会性感染病的致病菌，ICU中的新冠患者往往会使用大剂量的类固醇用于治疗炎 症，但这同时也会抑制人体免疫系统，给毛霉菌可乘之机。
[0004]毛霉菌目包括了55个属261个钟，其中至少有38种能明确导致人类感染，主要致病菌 包括根霉属(Rhizopus spp)、毛霉属(Mucor spp)和横梗霉属(Lichtheimia spp，旧称Absidia spp)， 其次是根毛霉属(Rhizomucor spp)、小克银汉霉属(Cunninghamella spp)、鳞质霉属 (Apophysomyces spp)等。
[0005]目前，毛霉病诊断方法主要包括常规检查法、血清免疫方法、分子生物学方法等，其中 常规检查法主要包括影像学、组织病理学和真菌培养等。即采用MRI或CT等影像学检查的 方式可以确定疾病程度，但是不能鉴定病原菌。采用组织病理切片HE、PAS或银染色或直接 镜检，根据真菌特征进行判断进行初步判断，但不具有特异性，鉴定不准确。真菌培养可以 进行属和种鉴定及抗真菌药敏试验等，但是周期较长，通常需要几天到几周的时间，导致病 情延误或用药不准，增加死亡率。血清免疫学检测特异性交叉，同时很难覆盖毛霉菌多种病 原体，因此在应用时难以排出真菌间的抗原交叉反应导致假阳性或假阴性从而导致误判，比 如2012年美国加州大学洛杉矶海滨分校医学中心的洛杉矶生物医学研究所申请的《利用CotH 的毛霉菌病的免疫疗法和诊断》(专利号：103998057A)可以用于检测米根霉(R.oryzae)引起 的毛霉菌病，但是对于其他类型的毛霉菌可能会存在漏检。分子检测方法是《2019年欧洲毛 霉病诊疗指南》中强烈推荐的方法，分子鉴定相对于形态学更可靠，优先推荐内部转录间隔 区(ITS)测序，是分子鉴定的最佳技术，可以用于流行病学研究，用于临床相对周期较长。 MALDI
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TOF鉴定依赖内部数据库，许多实验室不具备此条件。博奥生物2018年申请的专利 《引物组及其应用》(CN109706145B)采用了LAMP技术，提供的引物组合鉴定用于检测常 见的四种毛霉目真菌，即稻根霉菌(Rhizopus oryzae)、伞状毛霉菌(Lichtheimia corymbifera)、 卷枝毛霉菌(Mucor circinelloides)和/或微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)等4种毛霉菌病致 病菌，具有高特异性和高灵敏度，但是该专利检测的毛霉菌种类较少，只针对于4种毛霉菌 病致病菌进行检测，在临床上存在假阴性的问
题。因此综上所述，由于引起毛霉菌病的致病 菌种类较多，主要涉及毛霉菌目12个属38个种，不同地区毛霉病致病菌存在一些差异，比 如Apophysomyces variabilis和Apophysomyces elegans在全球范围比较罕见，但是在印度引起 的毛霉病占总发病率的7.9％～25％，仅次于米根霉引起的毛霉病，目前市面上针对于毛霉菌检 测的产品或专利均是根据国际上最常见的几种毛霉菌致病菌株进行设计和检测，不能很好地 覆盖印度地区的毛霉病致病菌种类，因此存在很大漏检的风险。
[0006]另外，市面上基于荧光定量PCR技术的毛霉菌核酸检测试剂盒采用常规qPCR技术，运 行时间长，不包括核酸提取，仅仅核酸扩增环节一般需要1～1.5小时，甚至更长，满足不了患 者的现场检测需求。进一步的，市面上或专利中基于荧光定量PCR技术的毛霉菌核酸检测试 剂盒均采用液体试剂的形式，该产品形式需要
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20℃的环境运输和保存，这种产品形式不适合 长时间运输，也不利于保存。

技术实现思路

[0007]本专利技术旨在提供一种检测毛霉菌病病原体的试剂盒及方法，以实现准确的检测毛霉菌病 病原体。
[0008]为了实现上述目的，根据本专利技术的一个方面，提供了一种检测毛霉菌病病原体的试剂盒。 该试剂盒包括毛霉菌病病原体寡核苷酸探针，毛霉菌病病原体寡核苷酸探针包括以下探针中 的至少一种：毛霉菌病病原体寡核苷酸探针1：5'
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AGTCATAATAAACAVGCCCAA
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3'；毛霉 菌病病原体寡核苷酸探针2：5'
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AGTCAAAAGAAACACGCCCAA
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3'；毛霉菌病病原体寡核苷 酸探针3：5'
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AGCCTTAATAGCCAAGCCC
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3'；毛霉菌病病原体寡核苷酸探针4： 5'
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TGTCCAAAGGATCAAGCC
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3'；毛霉菌病病原体寡核苷酸探针5： 5'
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AAGCCATAGAGCAAACCC
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3'；或毛霉菌病病原体寡核苷酸探针6： 5'
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CTGCCAGTGGCGAGGAC
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3'。
[0009]进一步地，试剂盒还包括：毛霉菌病病原体正向引物1： 5'
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ACCACAAACTATGCCGACTAGAGAT
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3'和毛霉菌病病原体反向引物1： 5'
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CCCAAAAACTTTACTTTCGCTAAG
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3'；或毛霉菌病病原体正向引物2：5'
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GGGATCGAAGACGATTAGATACCG
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3'和毛霉菌病病原体反向引物2：5'
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CAGAACCCAAAAACTTTACTTTCGC
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3'。
[0010]进一步地，毛霉菌病病原体寡核苷酸探针的5
’
端标记有荧光报告基团，3
’
端标记有荧光淬 灭基团和/或MGB。
[0011]进一步地，荧光报告基团选自FAM、NEX、ROX、TET、TAMRA、JOE、VIC、CY3、 CY5或Texas Red。
[0012]进一步地，荧光淬灭基团选自BHQ、TAMRA、Eclipse、Dabcyl、Lowa BlackTM RQ或 Lowa BlackTM FQ。
[0013]进一步地，试剂盒还包括PCR反应液本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测毛霉菌病病原体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括毛霉菌病病原体寡核苷酸探针，所述毛霉菌病病原体寡核苷酸探针包括以下探针中的至少一种：毛霉菌病病原体寡核苷酸探针1：5'
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AGTCATAATAAACAVGCCCAA
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3'；毛霉菌病病原体寡核苷酸探针2：5'
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AGTCAAAAGAAACACGCCCAA
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3'；毛霉菌病病原体寡核苷酸探针3：5'
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AGCCTTAATAGCCAAGCCC
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3'；毛霉菌病病原体寡核苷酸探针4：5'
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TGTCCAAAGGATCAAGCC
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3'；毛霉菌病病原体寡核苷酸探针5：5'
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AAGCCATAGAGCAAACCC
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3'；或毛霉菌病病原体寡核苷酸探针6：5'
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CTGCCAGTGGCGAGGAC
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3'。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：毛霉菌病病原体正向引物1：5'
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ACCACAAACTATGCCGACTAGAGAT
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3'和毛霉菌病病原体反向引物1：5'
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CCCAAAAACTTTACTTTCGCTAAG
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3'；或毛霉菌病病原体正向引物2：5'
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GGGATCGAAGACGATTAGATACCG
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3'和毛霉菌病病原体反向引物2：5'
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CAGAACCCAAAAACTTTACTTTCGC
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3'。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述毛霉菌病病原...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄超杰，张萌，黄华香，张涛，
申请(专利权)人：广东润鹏生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：