本发明专利技术公开了一种基于微流控芯片制备时间分辨冷冻电镜样品的方法及装置。通过设计微流控芯片，使生化反应的底物进入微流控芯片的反应通道，在反应发生后的不同时间点通过连接在反应通道不同位置处的输出通道将反应溶液引出，并通过枪头快速涂写或喷射在金属载网上，获取反应过程中不同时间点上的样品，然后快速进行冷冻制样，实现对时间分辨的样品进行冷冻电镜数据采集和分析。本发明专利技术使捕获生物样品短时间尺度（如微秒级）的中间状态成为可能，从而获得生物分子三维结构与构象分布随时间的演化特征。的演化特征。的演化特征。
【技术实现步骤摘要】
一种基于微流控芯片制备时间分辨冷冻电镜样品的方法及装置
[0001]本专利技术涉及一种具有时间分辨的冷冻电镜生物样品的制备技术，具体涉及一种通过设计微流控芯片获取不同时间点冷冻电镜样品的方法和装置，属于生物技术和实验设备领域。
技术介绍
[0002]冷冻电子显微镜技术是生物分子结构解析领域中应用最为广泛的重要方法之一，能够在接近天然状态下重建生物分子近原子分辨率的三维结构。冷冻电镜技术的工作流程一般分为实验样品的准备与图像数据的处理。其中，准备实验样品包括生物分子的纯化、冷冻样品的制备与电镜图像的获取等操作，对最终高分辨率结构的成功解析具有决定性作用。
[0003]传统的冷冻样品制备技术中，将纯化好的生物样品加载在金属载网上，使用滤纸吸去多余溶液后，快速插入液态乙烷中，在生物分子周围形成一层非晶态冰，用于保护样品，提高生物分子样品抗电子辐照损伤的能力。然而，生命体中的功能分子一般处于高度动态的非平衡过程中，具有非常复杂的动力学特征，因而其结构特征通常会在生化反应的不同时间点上呈现不同的信息，这类信息通过传统的冷冻制样方法是难以捕获的。在应用冷冻电子显微镜提供近原子水平分辨率的信息以外，我们需要进一步表征分子结构的连续变化状态以及动力学过程，以进一步探索生物分子发挥功能时的工作机理，更好地解决实际问题。
[0004]微流控芯片是利用微电子平面光刻加工技术等非常规微纳米加工技术制备的微型分析系统。微流控技术一般以微沟道网络为基础，包括微泵、微阀等部件，可以实现精确的时空环境控制和时序观测。
专利技术内容
[0005]本专利技术的目的是提供一种基于微流控芯片制备时间分辨冷冻电镜样品的方法及装置，用以解决生物分子发挥生物学功能时在非平衡过程中不同时间点上的结构信息捕获问题。
[0006]本专利技术通过设计微流控芯片，使生化反应的底物进入微流控芯片的反应通道，在反应发生后的不同时间点通过连接在反应通道不同位置处的输出通道将反应溶液引出，并通过枪头快速涂写或喷射在金属载网上，获取反应过程中不同时间点上的样品，然后快速进行冷冻制样，实现对时间分辨的样品进行冷冻电镜数据采集和分析，从而获得生物分子三维结构与构象分布随时间的演化特征。
[0007]具体的，本专利技术的技术方案是：一种基于微流控芯片制备时间分辨冷冻电镜样品的方法，包括以下步骤：1）设计并制备微流控芯片，所述微流控芯片设置有输入通道、反应通道和输出通
道，其中多个输入通道汇集到反应通道，在反应通道的不同位置引出输出通道，输出通道通向位于微流控芯片侧面的输出口；2）将位于微流控芯片侧面的每个输出口连接枪头，在枪头的喷涂方向上设置金属载网；3）将不同反应底物通过不同输入通道输入微流控芯片，汇集到反应通道中进行混合并发生反应，在反应溶液流经反应通道的过程中，在不同时间点进入不同的输出通道，再通过输出通道经输出口由枪头涂写或喷射到金属载网上，得到不同时间点的反应样品；4）将获取了不同时间点反应样品的金属载网立即进行冷冻制样，得到时间分辨冷冻电镜样品。
[0008]上述步骤1）中所述微流控芯片包括上、下基片及夹在两个基片之间的微流层，在微流层中设置所述输入通道、反应通道和输出通道。所述基片的材料可以是硅、玻璃、石英等，所述微流层由高分子聚合物加工而成。常用的高分子聚合物例如聚二甲基硅氧烷（PDMS）、聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）、聚酰胺（PA）、聚对苯二甲酸丁二醇酯（PBT）、聚碳酸酯（PC）等。所述输出通道的输出口位于微流控芯片的侧面，而输入通道的输入口可以设置在微流控芯片的正面（上表面），以方便注入反应底物。
[0009]在微流控芯片中通道的直径大小将影响溶液的流速，一般将输入通道、反应通道和输出通道的直径设置为100
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200 μm。在步骤1）可以是在一个微流控芯片中设置多个输出通道连接一个反应通道，在反应发生后的不同时间点引出反应溶液；也可以制备一组微流控芯片，这一组微流控芯片具有相同的输入通道设置，但不同微流控芯片的反应通道长度不同，每个反应通道连接一个输出通道，不同微流控芯片用于引出不同时间点的反应溶液，在步骤3）利用这一组微流控芯片进行平行实验，获得不同时间点的反应样品。优选的，这一个微流控芯片或一组微流控芯片上的各输出通道的直径相同，长度相等，以便使流出的反应溶液更准确地对应于反应的不同时间点。
[0010]上述步骤2）中所述枪头从输入端到输出端内径逐级减小，以增大溶液的流出速度，使其在金属载网上涂写或喷射所用时间更短。优选的，所述枪头的输入端的截面内径为100
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200 μm，输出端的孔径为10
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20 μm，枪头长度为500
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800 μm，从枪头的输入端到输出端内径分多级减小，每一级的内径减小方式为将内壁设计成流线型曲面（参见图5）。
[0011]上述步骤2）中可以通过镊子将金属载网固定在对应的枪头附近。
[0012]上述步骤3）在向金属载网喷涂反应溶液前，对金属载网进行辉光放电清洁，并进行预冷。
[0013]上述步骤4）将获取了不同时间点反应样品的金属载网迅速浸入液态乙烷中，进行快速冷冻。
[0014]本专利技术还提供了一种基于微流控芯片制备时间分辨冷冻电镜样品的装置，包括微流控芯片、枪头和金属载网，所述装置是在一个微流控芯片中设置多个输入通道、一个反应通道和多个输出通道，其中，多个输入通道汇集到反应通道，在反应通道下游不同位置分别引出一个输出通道，每个输出通道通向位于微流控芯片侧面的输出口，在每个输出口连接枪头，在每个枪头的喷涂方向上设置金属载网；或者，所述装置包括一组微流控芯片，在不同微流控芯片中设置相同的多个输入通道和一个长度不同的反应通道，反应通道连接一个输出通道，输出通道通向位于微流控芯片侧面的输出口，在输出口连接枪头，在枪头的喷涂
方向上设置金属载网。
[0015]本专利技术用于制备时间分辨冷冻电镜样品的装置可以根据需求控制生物样品发生反应的温度，使反应环境与真实情况更一致，或调节合适的反应速率。
[0016]当生物样品量充足时，优选采用一组微流控芯片对每个时间点上的冷冻样品进行单独制备，即制作多个反应通道长度不同的微流控芯片，在对应的金属载网上分别同时进行溶液涂写（参见图4）。
[0017]金属载网样品的加载可以通过特制枪头喷射的方式进行，在输出通道的末端打孔后，将经过空气增压泵加压的气体由小孔泵入输出通道末端，与输出通道中的溶液一同喷射到金属载网上，得到厚度合适的样品层，使得冷冻用时更短。
[0018]通过本专利技术所提供的基于微流控芯片制备时间分辨冷冻电镜样品的方法和装置，实现了对时间分辨冷冻电镜样品的制备，提高了样品发生生化反应的可控性，使捕获生物样品短时间尺度（如微秒级）的中间状态成为可能。
附图说明
[0019]图1是设计微流控芯片制备时间分辨冷冻电镜样品的流程图。
[0020]图2是通过一个微流控芯片获取反应不同时间点上生物样品的装置俯视图。...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种基于微流控芯片制备时间分辨冷冻电镜样品的方法，其特征在于，包括以下步骤：1) 设计并制备微流控芯片，所述微流控芯片设置有输入通道、反应通道和输出通道，其中多个输入通道汇集到反应通道，在反应通道的不同位置引出输出通道，输出通道通向位于微流控芯片侧面的输出口；2) 将位于微流控芯片侧面的每个输出口连接枪头，在枪头的喷涂方向上设置金属载网；3) 将不同反应底物通过不同输入通道输入微流控芯片，汇集到反应通道中进行混合并发生反应，在反应溶液流经反应通道的过程中，在不同时间点进入不同的输出通道，再通过输出通道经输出口由枪头涂写或喷射到金属载网上，得到不同时间点的反应样品；4) 将获取了不同时间点反应样品的金属载网立即进行冷冻制样，得到时间分辨冷冻电镜样品。2.如权利要求1所述的基于微流控芯片制备时间分辨冷冻电镜样品的方法，其特征在于，所述微流控芯片包括上、下基片及夹在两个基片之间的微流层，在微流层中设置所述输入通道、反应通道和输出通道。3.如权利要求2所述的基于微流控芯片制备时间分辨冷冻电镜样品的方法，其特征在于，所述基片的材料选自硅、玻璃和石英；所述微流层由高分子聚合物加工而成，所述高分子聚合物选自聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯、聚酰胺、聚对苯二甲酸丁二醇酯和聚碳酸酯。4.如权利要求1所述的基于微流控芯片制备时间分辨冷冻电镜样品的方法，其特征在于，所述输入通道的输入口设置在微流控芯片的上表面。5.如权利要求1所述的基于微流控芯片制备时间分辨冷冻电镜样品的方法，其特征在于，所述微流控芯片中输入通道、反应通道和输出通道的直径为100
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200 μm。6.如权利要求1所述的基于微流控芯片制备时间分辨冷冻电镜样品的方法，其特征在于，步骤1）在一个微流控芯片中设置多个输出通道连接一个反应通道，在步骤3）反应发生后通过多个输出通道在不同时间点引出反应溶液；或者，在步骤1）制备一组微流控芯...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴赵龙，韩旭，毛有东，欧阳颀，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：
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