UBE2S调控PTEN-AKT信号轴促进HCC化疗耐药原因的验证方法技术

本发明专利技术提供一种UBE2S调控PTEN

【技术实现步骤摘要】
UBE2S调控PTEN
‑
AKT信号轴促进HCC化疗耐药原因的验证方法


[0001]本专利技术涉及HCC治疗领域，具体为UBE2S调控PTEN
‑
AKT信号轴促进 HCC化疗耐药原因的验证方法。

技术介绍

[0002]肝细胞肝癌(HCC)是原发性肝癌中最常见的病理类型，具有起病隐匿且 侵袭性高的特点，多数患者在确诊时疾病已达到晚期。目前HCC的总体治疗效 果不理想，即使在接受根治性手术的患者中，5年复发率仍高达70％，5年的总 生存率低于20％，系统性治疗是晚期及复发性HCC患者的主要治疗方法，近年 来，虽然免疫治疗在肝癌中取得较大突破，但免疫治疗单药有效率低。
[0003]在多个瘤种中显示，免疫治疗与化疗联合能够显著提高有效率，避免快速 进展，是扩大获益人群的重要方向，其中奥沙利铂联合氟尿嘧啶方案 (FOLFOX4)显示出较好的疗效，是指南推荐最常用的化疗方案之一，该方案 耐受性较好，治疗窗宽，与其他药物相比更具有药物经济学效应。
[0004]但肝癌的化疗耐药性是导致治疗失败的主要原因，甚至本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.UBE2S调控PTEN
‑
AKT信号轴促进HCC化疗耐药原因的验证方法，其特征在于：包括如下过程：S1:验证HCC中UBE2S与耐药通路关系，在HCC细胞中沉默UBE2S，利用RNA
‑
seq技术和基因富集分析证实UBE2S与耐药通路；S2:验证HCC细胞中UBE2S表达对氟尿嘧啶和奥沙利铂的耐药性；S3:验证转录因子FOXM1与UBE2S表达的相关性；S4:验证FOXM1
‑
UBE2S下游分子及其调控作用；S5:体内实验，构建裸鼠肝细胞癌原位移植瘤模型，验证FOXM1
‑
UBE2S
‑
PTEN
‑
AKT(p
‑
AKT)通路在体内的作用；体外实验，选取接受氟尿嘧啶及奥沙利铂治疗的HCC患者的癌组织及癌旁组织，检测癌组织和癌旁组织中PTEN和UBE2S表达水平，并分析其与患者的临床病理特征及化疗药物敏感性的相关性。2.根据权利要求1所述的UBE2S调控PTEN
‑
AKT信号轴促进HCC化疗耐药原因的验证方法，其特征在于：S1具体过程如下：细胞株和细胞培养：HCC细胞株(Hep3B,MHCC
‑
97L,HepG2,Huh7和PLC/PRF/5)；DMEM培养基(DMEM,Gibco,USA)加入10％胎牛血清(FBS,Hyclone,USA)和1％青霉素链霉素混合物(Invitrogen,USA)置于含有5％二氧化碳的37℃恒温箱内；
②
构建UBE2S沉默细胞：选取PLC/PRF/5细胞，将靶向UBE2S的特异性shRNA克隆到pLKO.1
‑
puro载体中；将其全长编码序列(CDS)克隆到pLenti
‑
CMV
‑
blast载体中以稳定的过表达UBE2S；细胞融合度达到50％时开始进行转染，随后用嘌呤霉素(3ug/ml)或杀稻瘟菌素(5ug/ml)进行筛选；
③
利用RNA测序技术和基因富集分析验证UBE2S与耐药通路关系密切。3.根据权利要求1所述的UBE2S调控PTEN
‑
AKT信号轴促进HCC化疗耐药原因的验证方法，其特征在于：S2具体过程如下：
①
测定UBE2S蛋白表达：选取HCC细胞株(Hep3B,MHCC
‑
97L,HepG2,Huh7和PLC/PRF/5)，分别用细胞裂解液裂解HCC细胞、提取蛋白，进行蛋白浓度测定；western blot检测UBE2S蛋白表达水平；
②
CCK
‑
8检测化疗耐药性：在上述5种HCC细胞中分别加入氟尿嘧啶或奥沙利铂，培养48小时后进行CCK
‑
8检测，使用酶标仪检测各组的OD值，计算细胞存活率和半抑制浓度(IC50)；
③
按照上述步骤构建UBE2S过表达或沉默的Huh7和PLC/PRF/5细胞，转染后再按照上述步骤进行CCK
‑
8检测，验证UBE2S表达及变化对HCC细胞化疗耐药性的影响。4.根据权利要求1所述的UBE2S调控PTEN
‑
AKT信号轴促进HCC化疗耐药原因的验证方法，其特征在于：S3具体过程如下：
①
根据TCGA
‑
LIHC数据库，基于人类转录因子和UBE2S共表达基因的重叠部分，验证HCC中转录因子FOXM1与UBE2S表达的相关性；在TCGA数据库中分析二者的相关性；RT
‑
PCR检测各HCC细胞株中FOXM1与UBE2SmRNA表达的相关性；
②
选取耐药性较高的MHCC
‑
97L细胞，按照上述方法构建FOXM1沉默的细胞，RT
‑
PCR和western blot分别检测UBE2S mRNA和蛋白表达水平，CCK
‑
8验证转染后的HCC细胞对氟尿嘧啶和奥沙利铂的耐药性；
③
利用TCGA
‑
LIHC数据库进行基因集富集分析，验证HCC中FOXM1是否上调UBE2S进一步影响细胞化疗药物耐药性；Kaplan
‑
Meier法分析FOXM1高表达HCC患者的生存情况；
④
选取MHCC
‑
97L细胞，按照上述方法构建UBE2S过表达
‑
FOXM1沉默的细胞，CCK
‑
8验证转染后的HCC细胞对氟尿嘧啶和奥沙利铂的耐药性；
⑤
利用EPD数据库确认UBE2S基因启动子区域；构建包含UBE2S启动子的荧光素酶报告基因载体，并将其转染到完成FOXM1稳定沉默或过表达的细胞中培养48小时，通过检测荧光素酶活性验证FOXM1表达变化对UBE2S启动子活性的影响；
⑥
使用JASPAR2020程序预测UBE2S基因中FOXM1的两个潜在结合位点，构建包含FOXM1结合位点突变的UBE2S启动子的荧光素酶报告基因载体，通过检...

【专利技术属性】
技术研发人员：桂亮，朱滢，章思偲，徐永子，
申请(专利权)人：桂亮，
类型：发明
国别省市：