一种涎液化糖链抗原KL-6的检测试剂及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种涎液化糖链抗原KL

【技术实现步骤摘要】
一种涎液化糖链抗原KL
‑
6的检测试剂及检测方法


[0001]本专利技术属于生化检测的
，特别是涉及一种涎液化糖链抗原 KL
‑
6的检测试剂及检测方法。

技术介绍

[0002]KL
‑
6(涎液化糖链抗原)是日本人Kohno于1985年发现的一种跨膜高分 子量黏蛋白，含有分子量约为200KD的唾液酸化糖链，该糖链主要是由 20个氨基酸残基组成的串联重复序列，具有被特异性抗体识别的空间结构 表位。在正常肺组织中，主要表达于型肺泡细胞和支气管上皮细胞的细胞 质和胞膜，部分表达于细支气管基底细胞和Clara细胞的细胞质及支气管腺 体，胰腺、胃及乳腺等器官组织的上皮细胞亦有部分表达。在日本和国内 开展的多项对KL
‑
6的研究显示，其作为间质性肺疾病(ILD)的血清学指 标显示出积极的临床意义，可用于间质行肺炎包括药物引导的间质性肺炎、 及胶原蛋白失调诱导的间质性肺炎等的诊断和确定治疗策略，用于诊断具 有肺癌、胰腺癌等的患者。
[0003]科研上kl
‑
6的常见检测方法主要有ELISA，荧光免疫层析、化学发光、 胶乳免疫增强比浊法，ELSA虽然是一种可靠的方法，但其操作及时效性不 能满足临床大量样本的检测，临床上国内现有两家KL
‑
6试剂盒，均为磁微 粒化学发光法，不仅成本高，操作复杂，且需要重新配置专用化学发光的 检测仪，相对而言，胶乳增强免疫比浊法为最为常见的生化分析法，生化 仪在医院和检验机构的普及率高，操作相对简便，且灵敏度和线性范围都 在需求范围内，是KL
‑
6批量检测的首选。但是国内尚未有该方法学的KL
‑
6 检测产品注册。
[0004]目前广泛使用的胶乳免疫比浊法制备试剂的方法主要有两种，一种是 将两株抗体按照一定比例混合，然后一起进行微球标记，因为不同抗体需 要的标记条件不一样，所以这种方法的精确度和精密度均不高，且抗体利 用率低，而另外一种方法就是将两株单抗分别偶联在不同粒径的胶乳微球 上，再按照一定比例混匀，这就涉及到多次的离心的超声和重悬操作，工 艺过于复杂，不利于放大生产。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种涎液化糖链抗原KL
‑
6的检测试剂及检测方 法，解决现有检测工艺和步骤过于复杂，不利于放大生产的问题。
[0006]为解决上述技术问题，本专利技术是通过以下技术方案实现的：
[0007]一种涎液化糖链抗原KL
‑
6的检测试剂，包括R1缓冲液、R2试剂和不 同浓度kl
‑
6抗原标准品，kl
‑
6抗原标准品浓度为0、250、500、1000、2500、 5000U/mL；
[0008]所述R1缓冲液配方如下：
[0009][0010]调节PH至7.0
±
0.05，定容至1L容量瓶，用0.22μm滤膜过滤，置于2
‑
8℃保存；
[0011]所述R2试剂的配置方法，包括以下步骤：
[0012](1)胶乳颗粒清洗；量取固含为10％的苯乙烯胶乳颗粒0.5ml加至 3.0ml的清洗缓冲液中，离心，20000转/分钟，30分钟，去上清，用3.0ml 活化缓冲液对胶乳微粒沉淀物重悬超声；
[0013](2)苯乙烯胶乳颗粒活化：加入活化剂对到上述清洗好的胶乳微粒中， 混匀，对胶乳微粒进行活化，37度活化0.5小时；
[0014](3)抗体标记偶联：将抗人KL
‑
6抗体加入到活化好的苯乙烯胶乳颗 粒溶液中，37℃摇床混匀2
‑
4h；
[0015](4)封闭：标记结束后开始离心，20000转/分钟，30分钟，去上清， 取5.0ml的封闭缓冲液对胶乳微粒沉淀物重悬超声，然后进行封闭，时间 为1小时；
[0016](5)封闭结束后开始离心，20000转/分钟，30分钟,去上清，加入150ml 胶乳保存液，超声重悬后得到乳白色溶液即为试剂R2。
[0017]进一步地，步骤(5)中胶乳保存液的配方如下，
[0018][0019]进一步地，kl
‑
6抗原标准品的配置：用含有1％BSA，0.8ml/L Proclin 300，PH为6.5
‑
7.5的磷酸盐缓冲液匹配制不同浓度的抗人KL
‑
6标准品， 除菌过滤。
[0020]进一步地，抗人kl
‑
6抗体包括但不限于兔、羊、鼠、鸡、鸭来源的单 克隆抗体或多克隆的非亲和的IgG抗体、亲和的IgG抗体或IgY抗体中的 一种或两种。
[0021]进一步地，所述苯乙烯胶乳颗粒为50
‑
150nm。
[0022]进一步地，步骤(1)中清洗缓冲液和活化缓冲液均为磷酸盐缓冲液。
[0023]进一步地，步骤(2)中活化剂为2％的EDAC 0.1ml，4％的NHS 0.2ml。 EDAC和NHS为双官能团交联剂。NHS为N
‑
羟基琥珀酰亚胺。
[0024]进一步地，步骤(4)中封闭缓冲液为1％BSA。
[0025]一种涎液化糖链抗原KL
‑
6的检测方法，采用涎液化糖链抗原KL
‑
6的 检测试剂，包括以下步骤，
[0026][0027]根据不同浓度kl
‑
6标准品的检测结果
△
A，绘制标准曲线，然后对样 本进行检测，得到样本的
△
A，将样本的
△
A对比标准曲线，得到样本中涎 液化糖链抗原KL
‑
6的浓度。
[0028]本专利技术具有以下有益效果：
[0029]实现了一工艺简单，操作简便、检测速度快、精密度和重复性都可以 和进口试剂盒相媲美的胶乳免疫比浊法测定KL
‑
6的试剂及检测方法。
[0030]将筛选好的KL
‑
6抗体标记在特定粒径的胶乳微球上，血清等样本中的 KL
‑
6与标记了抗体的胶乳微球发生抗原抗体反应，在特定波长下检测其吸 光度，吸光度的变化程度与样本中的KL
‑
6含量呈一定的线性关系。
附图说明
[0031]为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例描述所 需要使用的附图作简单地介绍。
[0032]图1：本专利技术不同试剂盒的标准曲线对比图。
[0033]图2：本专利技术相关性检查曲线图。
具体实施方式
[0034]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进 行清楚、完整地描述。
[0035]仪器及试剂
[0036]主要检测仪器：日立7180，
[0046]2.3 KL
‑
6标准品的配制
[0047]用含有1％B本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种涎液化糖链抗原KL
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6的检测试剂，其特征在于：包括R1缓冲液、R2试剂和不同浓度kl
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6抗原标准品，kl
‑
6抗原标准品浓度为0、250、500、1000、2500、5000U/mL；所述R1缓冲液配方如下：调节PH至7.0
±
0.05，定容至1L容量瓶，用0.22μm滤膜过滤，置于2
‑
8℃保存；所述R2试剂的配置方法，包括以下步骤：(1)胶乳颗粒清洗；量取固含为10％的苯乙烯胶乳颗粒0.5ml加至3.0ml的清洗缓冲液中，离心，20000转/分钟，30分钟，去上清，用3.0ml活化缓冲液对胶乳微粒沉淀物重悬超声；(2)苯乙烯胶乳颗粒活化：加入活化剂对到上述清洗好的胶乳微粒中，混匀，对胶乳微粒进行活化，37度活化0.5小时；(3)抗体标记偶联：将抗人KL
‑
6抗体加入到活化好的苯乙烯胶乳颗粒溶液中，37℃摇床混匀2
‑
4h；(4)封闭：标记结束后开始离心，20000转/分钟，30分钟，去上清，取5.0ml的封闭缓冲液对胶乳微粒沉淀物重悬超声，然后进行封闭，时间为1小时；(5)封闭结束后开始离心，20000转/分钟，30分钟,去上清，加入150ml胶乳保存液，超声重悬后得到乳白色溶液即为试剂R2。2.根据权利要求1所述一种涎液化糖链抗原KL
‑
6的检测试剂，其特征在于：步骤(5)中胶乳保存液的配方如下，。3.根据权利要求1所述一种涎液化糖链抗原KL
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6的检测试剂，其特征在于：kl
‑
6抗原标
准品的配置：用含有1％BSA，0.8ml/L Proclin 300，PH为6.5...

【专利技术属性】
技术研发人员：许小锋，沈杲，
申请(专利权)人：合肥诺为尔基因科技服务有限公司，
类型：发明
国别省市：