胎盘平滑绒毛膜脱细胞外基质材料的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种胎盘平滑绒毛膜脱细胞外基质材料的制备方法，包括以下步骤：(一)胎盘样本的预处理；(二)平滑绒毛膜预处理；(三)液氮反复冻融；(四)裂解液裂解细胞；(五)超声法脱细胞；(六)酶消化；(七)洗涤；(八)保存。本发明专利技术还公开了一种接种脂肪干细胞的脱细胞外基质材料的制备方法，包括以下步骤：A.制备胎盘平滑绒毛膜脱细胞外基质材料；B.制备脂肪干细胞：取脂肪组织，经过机械处理，酶消化和贴壁培养制备获取脂肪干细胞；C.接种脂肪干细胞。本发明专利技术以胎盘平滑绒毛膜为来源制备的脱细胞外基质生物材料，无伦理问题，来源广泛，免疫原性低，可用于多种组织的修复，具有很好的应用价值。价值。价值。

【技术实现步骤摘要】
胎盘平滑绒毛膜脱细胞外基质材料的制备方法


[0001]本专利技术涉及一种胎盘平滑绒毛膜脱细胞外基质材料的制备方法，以及接种脂肪干细胞的 脱细胞外基质材料的制备方法，属于医用材料


技术介绍

[0002]近年来随着生活水平的提高，人们越来越关注生活的质量。修复机体损伤的组织工程和 再生医学越来越受到人们的关注和研究。实现组织再生修复的基础是寻找合适的材料。脱细 胞外基质材料具有天然的三维空间结构，具有丰富的蛋白、多糖及细胞调控因子等成分，具 有良好的组织相容性，是最理想的生物材料之一。
[0003]目前脱细胞外基质的来源分为同种来源和异种来源。同种来源的优点是免疫原性相对较 低，跨物种病毒感染的风险小，缺点是来源难以保障，以及可能涉及一些伦理问题。异种来 源的脱细胞外基质的优点是材料易获得，成本低廉，无伦理方面的问题，缺点是免疫原性相 对较高，可能存在跨物种病毒等问题。
[0004]胎盘是人类分娩时的医疗废弃物，卫计委明文规定归产妇所有，所以产妇有权处理，不 存在伦理问题。胎盘组织含有丰富的造血干细胞、间充质干细胞等多种干细胞，是名副其实 的干细胞宝库，同时含有丰富的血管组织、羊膜组织，可以作为生物材料的来源。平滑绒毛 膜是胎盘羊膜下层的一层膜组织，含有丰富的血管组织。有许多文献提到平滑绒毛膜可以诱 导培养出间充质干细胞。
[0005]胎盘平滑绒毛膜组织脱去细胞后的外基质，三维结构非常适合人体自身的细胞迁移生长， 其自身所含的蛋白、多糖及细胞调控因子支持细胞的生长。另外胎盘绒毛膜面积较大，可以 根据需要，制备获得较大面积的脱细胞外基质。
[0006]脂肪干细胞来源于人的脂肪组织，具有取材方便，组织细胞增殖性高、免疫原性低、无 伦理争议等优点。人体自身脂肪组织富含脂肪干细胞，甚至在必要时，可以取少量自身脂肪 组织，在体外培养干细胞，然后移植回自身，进行机体修复或美容。脂肪干细胞被发现后， 受到广泛的研究，现被广泛用于医疗美容业和再生医学研究领域。

技术实现思路

[0007]针对上述现有技术，本专利技术提供了一种胎盘平滑绒毛膜脱细胞外基质材料的制备方法， 以及一种接种脂肪干细胞的脱细胞外基质材料的制备方法。
[0008]本专利技术是通过以下技术方案实现的：
[0009]胎盘平滑绒毛膜脱细胞外基质材料的制备方法，包括以下步骤：
[0010](一)胎盘样本的预处理：取胎盘样本，剔除淤血血块和破损组织块，用生理盐水反复 冲洗，直到生理盐水变清；清洗后，胎盘脐带面朝上放置，揭去胎盘羊膜，剪掉脐带。
[0011]胎盘样本处理应在万级二级生物实验室处理；胎盘应置于百级生物安全柜内用灭菌的不 锈钢器具盛放。
[0012]进一步地，对与胎盘样本同源的母血进行病毒检测，检测不合格的胎盘不予采用。
[0013](二)平滑绒毛膜预处理：选取完整平滑无硬块的区域，剪下平滑绒毛膜组织，剔除平 滑绒毛膜组织上的红色毛细血管组织，用生理盐水反复涮洗平滑绒毛膜组织，直到洗涤液变 清。
[0014]进一步地，所述平滑绒毛膜组织的尺寸大于等于25cm2。
[0015](三)反复冻融脱细胞：上述清洗的平滑绒毛膜组织，加入适量生理盐水，置于液氮中 使其快速冷冻，取出，解冻；重复冷冻、解冻过程1～3次。
[0016]具体操作方式如下：
[0017](1)上述清洗的平滑绒毛膜组织，取适量置入50ml规格的Corning离心管中，加入生 理盐水至40ml，旋紧盖子，用封口膜封口，在管壁上标记样本信息；
[0018](2)离心管放入液氮中10分钟，使样本快速结冰；
[0019](3)用夹子取出离心管，置于37℃恒温摇床上解冻：200rpm/min，震荡10分钟，使冰 块完全融化；
[0020](4)重复(2)和(3)，重复2次。
[0021](四)裂解液裂解细胞：上述处理的平滑绒毛膜组织，加入裂解液，37℃恒温摇床上裂 解细胞30min；
[0022]所述裂解液，选自Triton X
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100溶液，浓度为0.5～2.0％(质量体积分数，g/ml)，优 选1％。
[0023](五)超声法进一步脱细胞：上述处理的平滑绒毛膜组织，进行超声处理；用生理盐水 清洗残留的裂解液和脱落的组织，重复清洗1～3遍；
[0024]所述超声处理的具体参数为：水温40℃，超声处理2分钟后，停止，晃动离心管，再继 续超声2分钟。
[0025]所述进行超声处理的超声波清洗仪的超声频率为28KHz，功率200W。
[0026](六)酶消化去除细胞碎片：上述处理的平滑绒毛膜组织，沥干水分，加入混合酶溶液， 37℃下恒温摇床消化；
[0027]所述混合酶溶液，是由以下浓度的酶组成的：0.1％的胶原酶Ⅰ(质量体积分数，g/ml)， 0.25％的胰蛋白酶(质量体积分数，g/ml)，中性脂肪酶5～10U/ml，DNase 100U/ml，RNase 100μg/ml，溶剂为水。
[0028]具体操作方式为：将平滑绒毛膜组织置入50ml离心管中，加入混合酶溶液，定容到40ml， 37℃恒温摇床200rpm/min的速率，消化50min。
[0029](七)洗涤组织去除酶残留：上述处理的平滑绒毛膜组织，用生理盐水冲洗，加入甘油 或甘油溶液，离心，弃去上清液以去除酶残留，对上清液进行微生物检测，应检测不出微生 物。
[0030]具体操作方式为：将平滑绒毛膜组织置于带底座的100目不锈钢筛网上，用生理盐水冲 洗，正反面各冲洗3遍；将平滑绒毛膜组织置于50ml离心管中，加20％的甘油溶液(体积百 分数)至40ml，盖紧盖子封口，颠倒混匀，1000rpm/min瞬时离心，上清液做微生物检测； 弃去多余的上清液。
[0031](八)保存：上述处理的平滑绒毛膜组织，即为脱细胞外基质生物材料，可以新鲜使用； 若需要长期保存，则加入适量的40％甘油溶液(体积百分数)，封口保存，标记样本信息，置 于
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80℃深低温冰箱或者液氮罐中长期保存。
[0032]进一步地，所述胎盘样本，在收集时应满足以下条件：
[0033](1)样本收集之前必须和产妇及家属签订知情同意书和协议；胎盘样本必须是用含有双 抗的PBS储运液浸泡的储运盒保存；样本必须在48小时内到达实验室；运输的温度必须在4～ 25℃；
[0034](2)胎盘样本采集之前要调研产妇的健康状况；凡是有乙肝、丙肝、梅毒、艾滋、巨噬 细胞细胞病毒等传染性疾病的样本不得收集；
[0035](3)胎盘样本应该是完好无损的；若胎盘平滑绒毛膜撕裂严重，无完整的区域可供取样， 该胎盘样本不予接收；
[0036](4)随样本应该有母亲外周血一管，用于病毒检测。
[0037]一种接种脂肪干细胞的脱细胞外基质材料的制备方法，先制备胎盘平滑绒毛膜脱细胞外 基质材料，再接种脂肪干细胞，具体包括以下步骤：
[0038本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种胎盘平滑绒毛膜脱细胞外基质材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(一)胎盘样本的预处理：取胎盘样本，剔除淤血血块和破损组织块，用生理盐水冲洗；清洗后，胎盘脐带面朝上放置，揭去胎盘羊膜，剪掉脐带；(二)平滑绒毛膜预处理：选取完整平滑无硬块的区域，剪下平滑绒毛膜组织，剔除平滑绒毛膜组织上的红色毛细血管组织，用生理盐水涮洗平滑绒毛膜组织；(三)反复冻融脱细胞：上述清洗的平滑绒毛膜组织，加入生理盐水，置于液氮中使其快速冷冻，取出，解冻；重复冷冻、解冻过程1～3次；(四)裂解液裂解细胞：上述处理的平滑绒毛膜组织，加入裂解液，37℃恒温摇床上裂解细胞；所述裂解液，选自Triton X
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100溶液；(五)超声法进一步脱细胞：上述处理的平滑绒毛膜组织，超声处理；用生理盐水清洗残留的裂解液和脱落的组织，重复清洗1～3遍；所述超声处理的具体参数为：水温40℃，超声处理2分钟后，停止，晃动离心管，再继续超声2分钟；(六)酶消化去除细胞碎片：上述处理的平滑绒毛膜组织，沥干水分，加入混合酶溶液，37℃下恒温摇床消化；所述混合酶溶液，是由以下浓度的酶组成的：0.1％的胶原酶Ⅰ，0.25％的胰蛋白酶，中性脂肪酶5～10U/ml，DNase 100U/ml，RNase 100μg/ml，溶剂为水；(七)洗涤组织去除酶残留：上述处理的平滑绒毛膜组织，用生理盐水冲洗，加入甘油或甘油溶液，离心，弃去上清液以去除酶残留；(八)保存：上述处理的平滑绒毛膜组织，即为脱细胞外基质生物材料。2.根据权利要求1所述的胎盘平滑绒毛膜脱细胞外基质材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(三)中，具体操作方式如下：(1)上述清洗的平滑绒毛膜组织，取适量置入离心管中，加入生理盐水，旋紧盖子，用封口膜封口，在管壁上标记样本信息；(2)离心管放入液氮中10分钟，使样本快速结冰；(3)取出离心管，置于37℃恒温摇床上解冻：200rpm/min，震荡10分钟，使冰块完全融化；(4)重复(2)和(3)，重复2次。3.利用权利要求1或2所述的制备方法制备得到的胎盘平滑绒毛膜脱细胞外基质。4.一种接种脂肪干细胞的脱细胞外基质材料的制备方法，其特征在于：先制备胎盘平滑绒毛膜脱细胞外基质材料，再接种脂肪干细胞，具体包括以下步骤：A.制备胎盘平滑绒毛膜脱细胞外基质材料，包括以下步骤：(一)胎盘样本的预处理：取胎盘样本，剔除淤血血块和破损组织块，用生理盐水冲洗；清洗后，胎盘脐带面朝上放置，揭去胎盘羊膜，剪掉脐带；(二)平滑绒毛膜预处理：选取完整平滑无硬块的区域，剪下平滑绒毛膜组织，剔除平滑绒毛膜组织上的红色毛细血管组织，用生理盐水涮洗平滑绒毛膜组织；(三)反复冻融脱细胞：上述清洗的平滑绒毛膜组织，加入生理盐水，置于液氮中使其快速冷冻，取出，解冻；重复冷冻、解冻过程1～3次；
(四)裂解液裂解细胞：上述处理的平滑绒毛膜组织，加入裂解液，37℃恒温摇床上裂解细胞；所述裂解液，选自Triton X
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100溶液；(五)超声法进一步脱细胞：上述处理的平滑绒毛膜组织，超声处理；用生理盐水清洗残留的裂解液和脱落的组织，重复清洗1～3遍；所述超声处理的具体参数为：水温40℃，超声处理2分钟后，停止，晃动离心管，再继续超声2分钟；(六)酶消化去除细胞碎片：上述处理的平滑绒毛膜组织，沥干水分，加入混合酶溶液，37℃下恒温摇床消化；所述混合酶溶液，是由以下浓度的酶组成的：0.1％的胶原酶Ⅰ，0.25％的胰蛋白酶，中性脂肪酶5～10U/ml，DNase 100U/ml，RNase 100μg/ml，溶剂为水；(七)洗涤组织去除酶残留：上述处理的平滑绒毛膜组织，用生理盐水冲洗，加入甘油或甘油溶液，离心，弃去上清液以去除酶残留；(八)保存：上述处理的平滑绒毛膜组织，即为脱细胞外基质生物材料；B.制备脂肪干细胞：取脂肪组织，经过机械处理，酶消化和贴壁培养制...

【专利技术属性】
技术研发人员：温泉，李学凯，王盼，胡慧平，
申请(专利权)人：湖北省银丰鼎诚生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：