使用新型芳香异戊二烯基转移酶生物合成大麻素前体制造技术

一种通过使底物和香叶基焦磷酸或焦磷酸法尼酯与NphB直系同源物接触来生产大麻素前体的方法。NphB直系同源物来自大麻以外的生物体，所述底物可以是2,4

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用新型芳香异戊二烯基转移酶生物合成大麻素前体

技术介绍

[0001]链霉菌(Streptomyces sp.)菌株CL190中芳香异戊二烯基转移酶(NphB)的结构和功能已明确。见Kumano等人，Bioorg.Med.Chem.2008,16(17):8117
‑
26。之前的研究报告见Zirpel等人，J.Biotechnol.2017,259:204
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212，其表明NphB能够利用与来自大麻植物的膜结合型香叶基焦磷酸:二羟基戊基苯甲酸香叶基转移酶(geranylpyrophosphate:olivetolate geranyltransferase)相同的底物形成大麻素前体大麻萜酚酸(CBGA)。
[0002]众所周知，CBGA是大麻植物中发现的大麻素生物合成途径的第一个分支点，野生型NphB可以制备CBGA以及一种O
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异戊烯化副产物，即2
‑
O
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香叶基橄榄酸。
[0003]仍亟需合成已知的大麻素前体和具有特异性及高产率的新型大麻素前体的酶与方法。

技术实现思路

[0004]本文公开了一种生产大麻素前体的方法。所述方法包括使底物和香叶基焦磷酸或焦磷酸法尼酯与NphB直系同源物接触的步骤。所述底物可以是例如2,4
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二羟基
‑6‑
戊基苯甲酸或2,4
‑
二羟基
‑6‑
丙基苯甲酸，并且NphB直系同源物来自大麻以外的生物体。
[0005]本文还提供了解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)的重组细胞，在其基因组中携带编码NphB直系同源物的核酸。来自大麻以外的生物体的NphB直系同源物在重组细胞中表达。
[0006]在下文的说明书和实施例中对一个或多个实施方案进行了详细描述。根据详细描述、附图以及所附权利要求，其他特征、目的和优点将变得显而易见。
附图说明
[0007]下面参考附图描述本专利技术，其中：
[0008]图1示出了使用橄榄酸和香叶基焦磷酸作为底物的大麻素产品的结构。所有可能产物的分子式和分子量分别为C
22
H
31
O4和359.22。黑色：由三个单位的丙二酸单酰辅酶A衍生而来的橄榄酸的一部分；深灰色：由己酰
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辅酶A衍生的橄榄酸的一部分；浅灰色：由直系同源物转移的香叶基焦磷酸的一部分。
[0009]图2是用于将编码NphB直系同源物的基因整合到解脂耶氏菌基因组中的pYLEX1载体的示意图。
[0010]图3A示出了由三个NphB直系同源物生物合成的m/z＝359.22的大麻素前体的LC
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MS图谱：第1行＝CBGA标准品，第2行＝P3E2，第3行＝无酶阴性对照，第4行＝P3A5，第5行＝P3E8，第6行＝NphB阳性对照，第7行＝1BF1，第8行＝Y1C5。通过保留时间和相对峰面积确定峰。
[0011]图3B示出了从另外三个NphB直系同源物生物合成的m/z＝359.22的大麻素前体的LC
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MS图谱：第1行＝10μg/ml CBGA标准品，第2行＝无酶阴性对照，第3行＝NphB阳性对照，第4行＝P3F5，第5行＝P3A6，第6行＝1BC2。通过保留时间和相对峰面积确定峰。
[0012]图4示出了使用二芳酸(divarinic acid)(顶行)生物合成的潜在大麻素产物的结构，所述二芳酸与橄榄酸相比，碳单元少两个，从而产生比CBGA少两个碳的CBGVA，或者使用焦磷酸法呢酯(底行)代替香叶基焦磷酸，从而产生新的大麻素前体。
具体实施方式
[0013]本文公开了通过将异戊二烯单元从某些焦磷酸盐(如香叶基焦磷酸)转移到芳族聚酮化合物(如2,4
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二羟基
‑6‑
戊基苯甲酸(即橄榄酸)和2,4
‑
二羟基
‑6‑
丙基苯甲酸)中来催化大麻素前体生物合成的酶。这些酶来自大麻以外的生物体，可在大肠杆菌(Escherichia coli)或解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)中重组表达，随后用于其异戊二烯基转移酶活性。
[0014]如上所述，本文公开了一种生产大麻素前体的方法。在一个具体的实施例中，底物是橄榄酸，焦磷酸盐是香叶基焦磷酸，生产的大麻素前体具有359.22的质荷比和超过6.1分钟的保留时间(通过LC/MS分析确定)。本文所述的大麻素前体也在本专利技术的范围内。
[0015]在上述方法中，NphB直系同源物的来源可以是、但不限于玫瑰色链霉菌(Streptomyces roseochromogenus)亚种oscitans、红色链霉菌(Streptomyces rubidus)、肉桂地链霉菌(Streptomyces cinnamonensis)、杯状曲霉(Aspergillus calidoustus)、土曲霉(Aspergillus terreus)、克拉里黄梭菌(Clostridium clariflavum)、巴西诺卡氏菌(Nocardia brasiliensis)和未培养细菌esnapd16.1。
[0016]在所述方法的一个特定方面，NphB直系同源物具有SEQ ID NO:1
‑
8中任一个的氨基酸序列。或者，NphB直系同源物可具有与SEQ ID NO:1
‑
8中任一个至少70％相同(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、95％和99％)的氨基酸序列，并具有芳族异戊二烯基转移酶活性。
[0017]在一个示例性方法中，NphB直系同源物是重组酶。重组酶可以在例如大肠杆菌和解脂耶氏酵母中产生。
[0018]上文还提到了解脂耶氏酵母的重组细胞，在其基因组中包括编码NphB直系同源物的核酸。NphB直系同源物来自大麻以外的生物体。
[0019]NphB直系同源物的示例性来源是玫瑰色链霉菌(Streptomyces roseochromogenus)亚种Oscitans、红色链霉菌(Streptomyces rubidus)、肉桂地链霉菌(Streptomyces cinnamonensis)、杯状曲霉(Aspergillus calidoustus)、土曲霉(Aspergillus terreus)、克拉里黄梭菌(Clostridium clariflavum)、巴西诺卡氏菌(Nocardia brasiliensis)和未培养细菌esnapd16.1。
[0020]在特定重组细胞中，NphB直系同源物具有SEQ ID NO:1
‑
8中任一个的氨基酸序列。在另一个实施例中，NphB直系同源物可以具有与SEQ ID NO:1
‑
8中任一个至少70％相同(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、95％和99％)的氨基酸序列，并且具有芳族异戊二烯基转移酶活性本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种生产大麻素前体的方法，所述方法包括使底物和选自香叶基焦磷酸和焦磷酸法尼酯的焦磷酸盐与NphB直系同源物接触，其中所述底物是2,4
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二羟基
‑6‑
戊基苯甲酸(橄榄酸)或2,4
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二羟基
‑6‑
丙基苯甲酸，并且所述NphB直系同源物来自除大麻以外的生物体。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述底物是橄榄酸，所述焦磷酸盐是香叶基焦磷酸，并且所述大麻素前体通过LC/MS分析确定具有359.22的质荷比和超过6.1分钟的保留时间。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述NphB直系同源物来自玫瑰色链霉菌亚种oscitans、红色链霉菌、肉桂地链霉菌、杯状曲霉、土曲霉、克拉里黄梭菌、巴西诺卡氏菌和未培养细菌esnapd16.1。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述NphB直系同源物是在解脂耶氏酵母中产生的重组酶。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述NphB直系同源物来自玫瑰色链霉菌亚种oscitans、红色链霉菌、肉桂地链霉菌、杯状曲霉、土曲霉、克拉里黄梭菌、巴西诺卡氏菌和未培养细菌esnapd16.1。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述NphB直系同源物是在解脂耶氏酵母中产生的重组酶。7.根据权利要求1所述的方法，其中所述NphB直系同源物具有SEQ ID NO:1
‑
8中任一个的氨基酸序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴珮如，林杰翰，林艳平，姚文山，
申请(专利权)人：新加坡国立大学，
类型：发明
国别省市：