用于蛋白质和肽测序的方法和组合物技术

本公开描述了用于蛋白质和肽测序的方法和组合物。和组合物。和组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于蛋白质和肽测序的方法和组合物


[0001]本公开总的来说涉及用于蛋白质和肽测序的方法和组合物。

技术介绍

[0002]在过去十年中，DNA测序技术的快速改进产生了大量分子信息。并且尽管读取基因组的能力已经彻底改变了生物学研究，但大量的表型和疾病状态信息无法从基因组推断出来。RNA测序提供了对基因组功能元件及其表达水平的更深入了解。然而，围绕着将蛋白质与mRNA表达水平相关联的努力仍然存在重大挑战(de Sousa,Abreu,Penalva,Marcotte,&Vogel,2009)(Vogel&Marcotte,2012)，导致难以理解精确的蛋白质定量、修饰或甚至序列，导致细胞状态信息的丢失。在评估血清中的蛋白质时，RNA分析无法预测蛋白质的存在，因为蛋白质可能从细胞中排出并在整个血液系统中循环，导致RNA序列与其翻译的靶之间的空间连接丧失。此外，蛋白质测序可以揭示许多未知蛋白质，即存在于宿主的血流中并影响宿主生物体的来自于其他生物体(例如病毒、细菌等)的蛋白质。
[0003]RNA和DNA测序对抗本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种产生带条形码的多肽的方法，所述方法包括：在每个细胞中引入约一个构建物的条件下将表达构建物转化到微生物细胞中，其中所述表达构建物包含的核酸编码：(a)包含所述多肽、纯化标签和核酸结合蛋白(naBP)的融合蛋白；和(b)被所述naBP识别的核酸序列和独特的核酸条形码；并且将所述微生物在所述构建物被表达并且所述融合蛋白的naBP部分与naBP识别序列结合的条件下培养，从而产生带条形码的多肽。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物细胞选自真核或原核细胞。3.根据权利要求1或2所述的方法，其还包括纯化所述带条形码的多肽。4.根据权利要求1
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3中的任一项所述的方法，其中所述表达构建物包含任何拷贝数的与宿主生物体相容的复制原点。5.根据权利要求1
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4中的任一项所述的方法，其中表达由与宿主生物体相容的组成型、诱导型或阻遏型启动子的任何组合驱动。6.根据权利要求1
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5中的任一项所述的方法，其中所述系统的组分使用不同的启动子来表达。7.根据权利要求1
‑
6中的任一项所述的方法，其中所述系统的组分使用存在于所述表达构建物内的不同位置处的相同启动子来表达。8.根据权利要求1
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7中的任一项所述的方法，其中所述组分使用Gal 1,10
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双向启动子、ADH1、GDS、TEF、CMV、EF1a、SV40、T7、lac或与宿主生物体相容的任何其他启动子和启动子组合来表达。9.根据权利要求1
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8中的任一项所述的方法，其中所述纯化步骤包括使用与编码的纯化标签对应的下拉法下拉所述带条形码的多肽。10.根据权利要求1
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9中的任一项所述的方法，其中所述免疫沉淀步骤包括用蛋白质纯化磁珠(例如抗His抗体、琼脂糖、镍等)下拉所述带条形码的多肽。11.根据权利要求1
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10中的任一项所述的方法，其还包括使用温和的洗脱缓冲液例如甘氨酸从所述珠子洗脱所述带条形码的多肽，以在不使RNA
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蛋白质/肽结合变性的情况下释放出所述融合肽。12.根据权利要求1
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11中的任一项所述的方法，其中所述多肽包含一个或多个位点特异性蛋白酶切割位点，以便使用位点特异性蛋白酶(例如肠激酶、因子Xa、烟草蚀纹病毒蛋白酶、凝血酶)从抗亲和标签珠子释放出所述带条形码的多肽。13.根据权利要求1
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12中的任一项所述的方法，其中所述核酸序列包含限制性酶切割位点，以便使用限制性核酸内切酶从所述珠子释放出所述带条形码的多肽。14.根据权利要求1
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13中的任一项所述的方法，其中被核酸结合蛋白识别的核酸序列和所述核酸结合蛋白是MS2 RNA发夹或其变体和MS2噬菌体外壳蛋白或其突变体。15.根据权利要求1
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14中的任一项所述的方法，其中被核酸结合蛋白识别的核酸和所述核酸结合蛋白是boxB序列或其变体和噬菌体抗终止蛋白N(λN)。16.根据权利要求1
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15中的任一项所述的方法，其中在带条形码的多肽纯化之前将所述细胞用UV辐射照射。17.根据权利要求1
‑
16中的任一项所述的方法，其中将纯化的复合体用UV辐射照射。18.一种带DNA条形码的多肽或蛋白质，其通过根据权利要求1
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17中的任一项所述的方
法来制造。19.一种使用带荧光标签的适体对蛋白质或肽进行测序的方法，所述方法包括：(a)提供附连有至少一个蛋白质或肽的固相支持物，其中所述至少一个蛋白质或肽通过核酸连接物附连到所述固相支持物，其中所述核酸连接物包含测序接头序列；(b)将所述蛋白质或肽与对至少一个N
‑
端氨基酸表现出结合特异性的适体的文库在其中一个或多个适体特异性结合到所述蛋白质或肽的至少一个N
‑
端氨基酸的条件下温育，其中所述文库内的每个适体包含独特光学特征；(c)检测所述独特光学特征和所述独特光学特征的位置；(d)从所述蛋白质或肽移除所述适体并移除所述N
‑
端氨基酸，以产生N
‑
端氨基酸缩短的蛋白质或肽；(e)将所述N
‑
端氨基酸缩短的蛋白质或肽与对至少一个N
‑
端氨基酸表现出结合特异性的DNA适体的文库在其中一个或多个适体特异性结合到所述蛋白质或肽的至少一个N
‑
端氨基酸的条件下温育，其中所述文库内的每个适体包含肽结合性ssDNA区域和独特条形码序列，所述条形码序列包含指示第一次探针迭代和相关的肽结合性ssDNA区域的单个DNA条形码；(f)检测所述独特光学特征和所述独特光学特征的位置；(g)从所述蛋白质或肽移除所述适体并移除所述N
‑
端氨基酸，以产生N
‑
端氨基酸缩短的蛋白质或肽；(h)将步骤(b)
‑
(g)重复多次，以构建光学条形码的位置链；由此获得所述蛋白质或肽的序列。20.一种使用与带荧光标签的探针互补的适体对蛋白质或肽进行测序的方法，所述方法包括：(a)提供附连有至少一个蛋白质或肽的固相支持物，其中所述至少一个蛋白质或肽通过核酸连接物附连到所述固相支持物，其中所述核酸连接物包含测序接头序列；(b)将所述蛋白质或肽与对至少一个N
‑
端氨基酸表现出结合特异性的DNA适体的文库在其中一个或多个适体特异性结合到所述蛋白质或肽的至少一个N
‑
端氨基酸的条件下温育，其中所述文库内的每个适体包含一系列与指示所述测序轮次和相关的肽结合性ssDNA区域的光学标记的核酸探针互补的一个或多个序列，并且其中所述探针杂交区域被杂交到保护性互补寡核苷酸；(c)变性并洗掉所述保护性互补寡核苷酸；(d)将结合的适体与互补于所述适体条形码尾部的特定区域的带荧光标签的寡核苷酸探针温育；(e)检测所述独特光学特征和所述独特光学特征的位置；(f)变性并洗掉结合的探针；(g)将步骤(d)
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(f)重复所需的迭代次数；(h)从所述蛋白质或肽移除所述适体并移除所述N
‑
端氨基酸，以产生N
‑
端氨基酸缩短的蛋白质或肽；(i)将步骤(b)
‑
(h)重复多次，以构建光学条形码的位置链；由此获得所述蛋白质或肽的序列。
21.一种使用根据权利要求19或20所述的蛋白质测序方法来鉴定新的生物标志物的方法，所述方法包括：(a)提供来自于感兴趣的生物学样品和对照或比较生物学样品的蛋白质样品；(b)任选地除去非常高浓度的已知蛋白质；(c)执行根据权利要求19所述的方法的步骤(a)
‑
(h)或根据权利要求20所述的步骤(a)
‑
(i)；(d)将与来自于对照样品的每种低表达蛋白质相关的光学条形码读出的数目与感兴趣的样品进行比较；由此鉴定在对照样品与感兴趣的样品之间具有显著不同的相对表达水平的假设的生物标志物。22.一种使用根据权利要求19或20所述的蛋白质测序方法来评估疾病状态、评估对治疗的反应、预测治疗反应或其组合的方法，其中所述疾病的一种或多种征兆是已知蛋白质标志物的异常表达水平，所述方法包括：(a)提供来自于患者样品的蛋白质样品；(b)任选地剥离非常高浓度的已知蛋白质；(c)执行根据权利要求19所述的方法的步骤(a)
‑
(h)或根据权利要求20所述的步骤(a)
‑
(i)；(d)通过分析与已知蛋白质生物标志物相关的光学条形码读出的数目来确定已知生物标志物的相对量；由此确定存在或不存在已知生物标志物的表达水平与标准值的偏离。23.一种使用根据权利要求19或20所述的蛋白质测序方法来筛选潜在抗体的方法，所述方法包括：(a)提供来自于已免疫接种和未免疫接种生物学样品的血浆样品；(b)任选地剥离非常高浓度的已知蛋白质；(c)任地分离免疫球蛋白；(d)执行根据权利要求1所述的步骤(a)
‑
(h)或根据权利要求20所述的步骤(a)
‑
(i)；(e)将与来自于未免疫接种样品的每种肽相关的光学条形码读出的数目与感兴趣的已免疫接种样品进行比较；由此鉴定在未免疫接种样品与感兴趣的已免疫接种样品之间具有显著不同的相对表达水平的假设的抗体。24.根据权利要求19或20所述的方法，其还包括在步骤(a)之前将所述蛋白质或肽片段化。25.根据权利要求24所述的方法，其中所述片段化步骤包括用胰蛋白酶、另一种片段化酶或其组合将所述蛋白质或肽片段化。26.根据权利要求19
‑
25中的任一项所述的方法，其中所述蛋白质或肽的C
‑
端末端被附连到固相支持物。27.根据权利要求19
‑
25中的任一项所述的方法，其中所述蛋白质或肽的C
‑
端末端被附连到寡核苷酸尾部。28.根据权利要求19
‑
25中的任一项所述的方法，其中所述蛋白质或肽来自于生物学样
品。29.根据权利要求19
‑
25中的任一项所述的方法，其中所述生物学样品选自血液、尿液、唾液、组织活检样品、痰液、粪便、单个细胞、环境样品、细菌拭子或含有肽或蛋白质的任何样品。30.根据权利要求19
‑
25中的任一项所述的方法，其中所述蛋白质或肽是全长蛋白质、肽片段或包含在复合体内的蛋白质或肽。31.根据权利要求19
‑
25中的任一项所述的方法，其中所述独特的标记物选自荧光团、染料、纳米镧系元素和量子点。32.根据权利要求20
‑
25中的任一项所述的方法，其中所述光学标记的探针是与条形码序列互补的寡核苷酸。33.根据权利要求20
‑
25中的任一项所述的方法，其中在探针温育的同一次迭代中将一种或多种颜色的一种或多种寡核苷酸探针杂交到所述适体条形码尾部。34.根据权利要求19
‑
25中的任一项所述的方法，其中所述检测步骤使用光学成像、全内反射荧光(TIRF)、超分辨率显微镜、结构光学显微镜、广视野显微镜或共聚焦显微镜来进行。35.根据权利要求19
‑
25中的任一项所述的方法，其中所述适体文库包含在与适体结合无关的区域中部分为dsDNA的适体。36.根据权利要求19
‑
25中的任一项所述的方法，其中将所述dsDNA变性并将所述保护性互补寡核苷酸洗掉。37.根据权利要求19所述的方法，其中所述移除适体的步骤包括用限制性酶切割所述适体。38.根据权利要求19
‑
25中的任一项所述的方法，其中所述移除N
‑
端氨基酸的步骤包括所述蛋白质或肽的Edman降解、用一种或多种氨肽酶、热、pH或其组合切割所述蛋白质或肽。39.根据权利要求19
‑
25中的任一项所述的方法，其中被适体文库中的成员识别的氨基酸是天然氨基酸、未修饰的氨基酸和修饰的氨基酸。40.根据权利要求19
‑
25中的任一项所述的方法，其中所述适体文库使用RCHT
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SELEX或NTTA
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SELEX方法来产生。41.根据权利要求19
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25中的任一项所述的方法，其中所述适体对一个N
‑
端氨基酸表现出结合特异性。42.根据权利要求19
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25中的任一项所述的方法，其中所述适体对两个或更多个N
‑
端氨基酸表现出结合特异性。43.一种产生对序列内容具有高度控制的dsDNA寡核苷酸的方法，所述方法包括：(a)使用dsDNA连接酶将在序列延伸方向上具有5
’
磷酸化的单核苷酸突出部的dsDNA第一位lego块连接到在每个末端处均具有5
’
磷酸化的单核苷酸突出部的dsDNA第二位lego块，所述第二位lego块的一个突出部与所述第一位lego块的突出部互补，另一个突出部不互补，从而在所述第二位lego块上在序列延伸方向上留下一个5
’
磷酸化的单核苷酸突出部；(b)使用dsDNA连接酶将所述dsDNA第二位lego块连接到在每个末端处均具有5
’
磷酸化的一个或多个核苷酸突出部的dsDNA第三位lego块，所述第三位lego块的一个突出部与所
述第二位lego块的突出部互补，另一个突出部不互补，从而在所述第三位lego块上在序列延伸方向上留下一个5
’
磷酸化的单核苷酸突出部；(c)将步骤(a)
‑
(b)重复多次，直至序列构建物比所需长度短一个lego块；以及(d)将所述序列构建物连接到在序列延伸的相反方向上具有5
’
磷酸化的单核苷酸突出部的dsDNA最后位lego块。44.根据权利要求43所述的方法，其中所述lego块的3
’
或5
’
修饰与所使用的dsDNA连接酶相容。45.根据权利要求43或44所述的方法，其中为了产生随机文库，在需要多样性的特定位置处使用lego块的非均质池。46.根据权利要求43
‑
45中的任一项所述的方法，其中所述双链lego块使用T4 DNA连接酶或与所选连接酶利用的3
’
或5
’
末端修饰相容的任何其他dsDNA连接酶进行酶法连接。47.根据权利要求43
‑
46中的任一项所述的方法，其中所述连接反应在溶液中、珠子上、固相支持物上、凝胶中等进行。48.根据权利要求43
‑
47中的任一项所述的方法，其中所述第一位dsDNAlego块是PCR引物。49.根据权利要求43
‑
48中的任一项所述的方法，其中所述最后位dsDNAlego块是PCR引物。50.根据权利要求43
‑
49中的任一项所述的方法，其中将所述dsDNA产物PCR扩增以产生具有平行样的文库。51.根据权利要求43
‑
50中的任一项所述的方法，其中将PCR扩增后的dsDNA产物消化，以产生ssDNA文库。52.一种产生对序列内容具有高度控制的ssDNA寡核苷酸的方法，所述方法包括：(a)将ssDNA第一位lego块的3
’
末端连接到第二位ssDNA lego块的5
’
末端，其中参与所述连接的末端之一被磷酸化；(b)将所述ssDNA第二位lego块的3
’
末端连接到第三位ssDNA lego块的5
’
末端，其中参与所述连接的末端之一被磷酸化；(c)将步骤(a)
‑
(b)重复多次，直至序列构建物比所需长度短一个lego块；以及(d)将所述序列构建物连接到最后位lego块。53.根据权利要求52所述的方法，其中所述lego块的3
’
或5
’
修饰与所使用的ssDNA或RNA连接酶相容。54.根据权利要求52或53所述的方法，其中单链lego块使用RtcB ssRNA连接酶、CircLigase或与所选连接酶所需的3
’
或5
’
末端修饰相容的任何其他ssDNA或RNA连接酶进行酶法连接。55.根据权利要求52
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54中的任一项所述的方法，其中所述连接反应在溶液中、珠子上、固相支持物上、凝胶中等进行。56.根据权利要求52
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55中的任一项所述的方法，其中所述第一位ssDNAlego块是PCR引物。57.根据权利要求52
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56中的任一项所述的方法，其中所述最后位ssDNAlego块是PCR引物。
58.根据权利要求52
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57中的任一项所述的方法，其中将所述ssDNA产物PCR扩增以产生双链平行样的文库。59.根据权利要求52
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58中的任一项所述的方法，其中将PCR扩增后的dsDNA产物消化以产生ssDNA文库。60.一种产生对序列内容具有高度控制的RNA寡核苷酸的方法，所述方法包括：(a)将RNA第一位lego块的3
’
末端连接到第二位RNAlego块的5
’
末端，其中参与所述连接的末端之一被磷酸化；(b)将所述RNA第二位lego块的3
’
末端连接到第三位RNAlego块的5
’
末端，其中参与所述连接的末端之一被磷酸化；...

【专利技术属性】
技术研发人员：安娜莉莎，
申请(专利权)人：谷歌有限责任公司，
类型：发明
国别省市：