一种应用于固相合成的多孔树脂及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种应用于固相合成的多孔树脂及其制备方法，具体为一种功能基为氨基或羟基的多孔树脂及其制备方法。本发明专利技术以含有两个氰基的烯烃化合物为改性单体，以高内相乳液作为致孔剂，经悬浮聚合制得多孔树脂。再对多孔树脂进行官能化，得到功能基为氨基或羟基的多孔树脂。区别于现有的制备方法，改性单体可以使官能团分布更均匀，并且使多孔树脂在不同溶剂中的溶胀度接近。高内相乳液致孔可以使载体孔径分布更窄。该多孔树脂可以作为固相合成载体制备寡核苷酸，使用该载体有利于提高寡核苷酸的收率和纯度。苷酸的收率和纯度。苷酸的收率和纯度。

【技术实现步骤摘要】
一种应用于固相合成的多孔树脂及其制备方法


[0001]本专利技术涉及一种多孔树脂及其制备方法，该载体应用于寡核苷酸的固相合成，属于功能高分子材料制备领域。

技术介绍

[0002]在过去的几十年里，人工合成的寡核苷酸已经广泛应用于靶向基因治疗。寡核苷酸是一类有20个左右碱基的短链核苷酸的总称，包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。目前，寡核苷酸常使用化学方法合成，最通用的是固相亚磷酰胺三酯法合成，具体方法是将固相合成载体装填在反应柱中，将溶解有反应物的溶液在一定的压力下快速流过反应柱完成反应。为提高反应效率，减少杂质的产生，溶液中的反应物要快速扩散到固相合成载体内与活性位点反应，反应生成的产物能够快速扩散到溶液中被带走。这就要求固相合成载体满足如下要求：1.载体必须包含单一活性位点(或反应基团)，使核酸分子链能够连接在这些位点上，并在合成完成后能够裂解下来；2.载体在合成过程中应保持物理和化学稳定性；3.载体应有足够大的孔径和理想的孔径分布，有利于不断增长的核酸分子链和试剂能够快速地、不受阻碍地接触；4.活性位点在载体上应均匀分布，以减少核酸分子链之间的相互干扰；5.载体骨架应表现出一定的疏水性，因为用于寡核苷酸合成的亚磷酰胺单体对水分敏感，水分的存在会导致反应效率下降；6.载体在不同溶剂中溶胀度接近，减小不同溶剂合成或洗涤过程由于溶胀差异造成的死体积，有利于反应试剂的均匀扩散和反应产物的快速洗涤去除。
[0003]在寡核苷酸固相合成技术发展初期，常用的固相合成载体有孔径可控玻璃微球(CPG)、改性硅胶等无机颗粒符合上述要求，但其缺点也很明显，即取代度(Loading)低(一般小于100μmmol/g)，导致寡核苷酸单批次产量受限，设备利用率低，生产成本高。为提高载体的取代度，Nitto Denko公司和Ionis公司联合申请的专利技术专利WO2006029023以苯乙烯、对乙酰氧基苯乙烯、二乙烯基苯作为聚合单体，使用异辛烷、2
‑
乙基己醇作为致孔剂制备出有机高分子聚合物作为寡核苷酸固相合成载体。该载体的取代度可以达到100
‑
350μmmol/g，其缺点是载体较强的非极性导致使用鎓盐类缩合体系连接linker时反应效率较低，同时较强的非极性导致在合成或洗涤过程中使用甲苯和乙腈时树脂体积会发生较大变化，造成反应器中较大的死体积。随后，Nitto Denko公司在美国专利技术专利US8592542中，以苯乙烯、对乙酰氧基苯乙烯、二乙烯基苯、(甲基)丙烯酰胺衍生物作为聚合单体。在美国专利技术专利US8653152中，以苯乙烯、对乙酰氧基苯乙烯、二乙烯基苯、(甲基)丙烯腈作为聚合单体。通过在聚合过程中加入极性单体，制备出取代度更高(500μmmol/g以上)的寡核苷酸固相合成载体。同时，极性单体的加入，有利于调节载体在不同溶剂(甲苯、乙腈)中的溶胀波动。但随之而来的问题是(甲基)丙烯酰胺类单体、(甲基)丙烯腈较为亲水，使用无水溶剂(无水乙腈)洗涤时难以把氧化步骤中加入的水分去除，影响下一步寡核苷酸的合成效率。同时溶剂法致孔得到的载体孔径分布不均匀，传质效果差，也会影响水分的去除和下一步寡核苷酸的合成效率。南开大学申请的中国专利技术专利CN201210562165.9以交联聚丙烯腈或交联聚甲
基丙烯腈作为载体基本骨架。活性位点的引入通过加入乙酸乙烯酯、丙烯酸酯类或甲基丙烯酸酯类单体，通过碱解或与含有两个伯胺基的化合物反应引入羟基或氨基。此专利使用大量极性单体，使树脂在不同溶剂中的溶胀差异问题得以解决，但由于大量亲水性单体的使用，造成载体极为亲水，使用无水溶剂(乙腈)洗涤更加难以把载体中的水分去除，极大的影响下一步寡核苷酸的合成效率。
[0004]由于近年来寡核苷酸药物的研究取得巨大进展，越来越多的寡核苷酸药物开始进入临床阶段。对寡核苷酸合成载体的需求量越来越多，同时上述寡核苷酸载体存在的传质、溶胀、极性问题导致寡核苷酸合成效率低，生产成本高。因此开发出一种多孔树脂使寡核苷酸药物可以大规模、低成本、高效率地合成，满足核苷酸药物市场需求是极有必要的。

技术实现思路

[0005]为实现寡核苷酸大规模、低成本的生产，克服现有载体传质效率低、洗涤过程不彻底、在不同溶剂中溶胀变化大的缺点，本专利技术提供了一种应用于固相合成的多孔树脂及其制备方法。
[0006]为了提高传质效率，本专利技术希望实现孔径大小合适并且均一的孔径分布。本专利技术使用高内相乳液作为模板致孔，与传统的致孔方法如反相法、相分离法、溶剂致孔法相比，该方法可以通过乳液液滴的大小准确控制孔径和分布。内相乳液液滴的大小又可以通过油溶性表面活性剂的分子量、HLB值、用量等因素确定。本专利技术改变了致孔方式使得载体具有合适的孔径且孔径分布较窄，有利于寡核苷酸合成过程中反应试剂的扩散，提高反应效率，减少杂质的生成。
[0007]在聚合过程中加入改性单体有四方面作用：第一，改性单体聚合速度较慢，不能进行均聚，只能与其他单体进行共聚，有利于活性位点的均匀分布。第二，加入少量改性单体即可对树脂的溶胀性能进行较大范围的调节，降低载体在不同溶剂中的溶胀体积变化，减小在寡核苷酸合成过程中反应器内部的死体积。第三，改性单体分子结构可以使鎓盐类缩合剂更为高效，保证连接linker的效率。第四，改性单体和(甲基)丙烯酰胺类单体、(甲基)丙烯腈相比较为疏水，可以降低水在载体内的传质阻力，减少水对寡核苷酸合成过程的影响，提高反应效率和收率。
[0008]本专利技术公开了一种应用于固相合成的多孔树脂，所述多孔树脂的其聚合物骨架和功能基的结构可用下式表示：
[0009][0010]其中，R1＝C或C
‑
CH2；R2＝OH或CH2OH或NH2或CH2NH2或CH2OOC
‑
C6H4‑
OH或CH2OOCCH2‑
C6H4‑
OH或(CH2)4OOC
‑
C6H4‑
OH或(CH2)4OOCCH2‑
C6H4‑
OH或COONH
‑
C6H4‑
NH2或CH2COONH
‑
C6H4‑
NH2或COO
‑
C6H4‑
OH或CH2COO
‑
C6H4‑
OH；R3＝H或CH3(CH2)
n
(n＝0
‑
4)或CH3(CH2)
n O(n＝0
‑
4)。
[0011]所述应用于固相合成的多孔树脂的羟基或氨基的含量范围为100
‑
1000μmmol/g，优选为400
‑
700μmmol/g。
[0012]所述应用于固相合成的多孔树脂的粒径范围为35
‑
200μm，优选为50
‑
100μm。
[0013]所述应用于固相合成的多孔树脂的平均孔径为10
‑
200nm，优选为40
‑
100nm。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种应用于固相合成的多孔树脂，其特征在于，所述多孔树脂的聚合物骨架和功能基的结构可用下式表示：其中，R1＝C或C
‑
CH2；R2＝OH或CH2OH或NH2或CH2NH2或CH2OOC
‑
C6H4‑
OH或CH2OOCCH2‑
C6H4‑
OH或(CH2)4OOC
‑
C6H4‑
OH或(CH2)4OOCCH2‑
C6H4‑
OH或COONH
‑
C6H4‑
NH2或CH2COONH
‑
C6H4‑
NH2或COO
‑
C6H4‑
OH或CH2COO
‑
C6H4‑
OH；R3＝H或CH3(CH2)
n
(n＝0
‑
4)或CH3(CH2)
n
O(n＝0
‑
4)。2.根据权利要求1所述的应用于固相合成的多孔树脂，其特征在于，所述多孔树脂中羟基或氨基的含量为100
‑
1000μmmol/g。3.根据权利要求2所述的应用于固相合成的多孔树脂，其特征在于，所述多孔树脂中羟基或氨基的含量为400
‑
700μmmol/g。4.根据权利要求1所述的应用于固相合成的多孔树脂，其特征在于，所述多孔树脂粒径范围为35
‑
200μm。5.根据权利要求4所述的应用于固相合成的多孔树脂，其特征在于，所述多孔树脂粒径范围为50
‑
100μm。6.根据权利要求1所述的应用于固相合成的多孔树脂，其特征在于，所述多孔树脂的平均孔径为10
‑
200nm。7.根据权利要求6所述的应用于固相合成的多孔树脂，其特征在于，所述多孔树脂的平均孔径为40
‑
100nm。8.根据权利要求1所述的应用于固相合成的多孔树脂的制备方法，其特征在于：制备过程包括以下步骤：A.分别配制水相和油相，水相组成：水、分散剂、无机盐；油相组成：单乙烯基化合物、交联单体、功能单体、改性单体、油溶性表面活性剂、稀释剂和引发剂，其中，单乙烯基化合物、交联单体、功能单体和改性单体可以参与聚合反应，统称为单体，油溶性表面活性剂和稀释剂不参与聚合反应，主要起致孔作用，统称为致孔剂；B.将油相加入水相中，开动搅拌并升温进行反应，反应结束后除去致孔剂，得到多孔聚
合物树脂。9.根据权利要求8所述的应用于固相合成的多孔树脂制备方法，其特征在于，多孔聚合物树脂可以进一步反应，得到含有功能基为羟基或氨基的多孔树脂。10.根据权利要求8所述的应用于固相合成的多孔树脂制备方法，其特征在于，所述单乙烯基化合物为芳香族单乙烯基化合物。11.根据权利要求10所述的应用于固相合成的多孔树脂制备方法，其特征在于，所述单乙烯基化合物包括苯乙烯及其苯环取代衍生物，取代基为含有1至5个碳原子的烷基或烷氧基。12.根据权利要求8所述的应用于固相合成的多孔树脂制备方法，其特征在于，所述交联单体为具有两个及以上非共轭乙烯基的多官能团单体。13.根据权利要求12所得的应用于固相合成的多孔树脂制备方法，其特征在于，所述交联单体为二乙烯基苯。14.根据权利要求8所述的应用于固相合成的多孔树脂制备方法，其特征在于，所述功能单体是指单体中既含有可以进行自由基聚合的双键，又具有羟基、氨基、卤代基团或其他可通过反应可转化为羟基、氨基的基团。15.根据权利要求14所述的应用于固相合成的多孔树脂制备方法，其特征在于，所述功能单体包括羟基苯乙烯及其衍生物，如4
‑
羟基苯乙烯；羟烷基苯乙烯及其衍生物，如4
‑
羟甲基苯乙烯；酰氧基苯乙烯及其衍生物，如4
‑
乙酰氧基苯乙烯、苯甲酰氧基苯乙烯；氨基苯乙烯及其衍生物，如4
‑
氨基苯乙烯；氨烷基苯乙烯及其衍生物，如4
‑
氨甲基苯乙烯；卤烷基苯乙烯单体，如4
‑
(4
‑
溴丁基)苯乙烯、对氯甲基苯乙烯；4
‑
乙烯基苯基酯单体，如4
‑
乙烯基苯甲酸甲酯，4
‑
乙烯基苯乙酸乙酯。16.根据权利要求8所述的应用于固相合成的多孔树脂制备方法，其特征在于，所述改性单体是指单体中含有可以参与自由基聚合的双键，又具有两个氰基。17.根据权利要求16所述的应用于固相合成的多孔树脂制备方法，其特征在于，所述改性单体包括反丁烯二腈、1,4
‑
二氰基
‑2‑
丁烯。18.根据权利要求8所述的应用于固相合成的多孔树脂制备方法，其特征在于，所述引发剂为有机过氧化物或偶氮化合物。19.根据权利要求18所述的应用于固相合成的多孔树脂制备方法，其特征在于，所述引发剂包括过氧化苯甲酰、过氧化月桂酰、过氧化
‑2‑
乙基己酸叔丁酯、偶氮二异丁腈、偶氮二异戊腈、偶氮二异庚腈。20.根据权利要求8所述的应用于固相合成的多孔树脂制备方法，其特征在于，所述油溶性表面活性剂为不参与聚合反应，不溶于水或微溶于水的表面活性剂。21.根据权利要求20所述的应用于固相合成的多孔树脂制备方法，其特征在于，所述油溶性表面活性剂包括失水山梨醇三油酸酯、聚氧乙烯山梨醇蜂蜡衍生物、失水山梨醇三硬脂酸酯、聚氧乙烯山梨醇六硬脂酸酯、乙二醇脂肪酸酯、丙二醇脂肪酸酯、丙二醇单硬脂酸酯、失水山梨醇倍半油酸酯、聚氧乙烯山梨醇油酸酯、单硬脂酸甘油酯、羟基化羊毛脂、失水山梨醇单油酸酯、丙二醇单月桂酸酯中的一种或几种的组合。22.根据权利要求8所述的应用于固相合成的多孔树脂制备方法，其特征在于，所述稀释剂为不参与聚合反应、不溶于水或微溶于水的有机溶剂。
23.根据权利要求22所述的应用于固相合成的多孔树脂制备方法，其特征在于，所述稀释剂包括芳香烃如苯、甲苯、乙苯；脂肪烃如含有6个到12个碳的直链、支链或环烷烃如己烷、庚烷、辛烷、十二烷、异辛烷、异十二烷、环己烷等；卤代烃如氯仿、氯苯；含有4个碳以上的酯如乙酸乙酯、乙酸丁酯、邻苯二甲酸二丁酯等；醇如含有4个到12个碳的直链、支链或环烷烃醇如己醇、环己醇、辛醇、异辛醇、癸醇、十二醇。24.根据权利要求8所述的应用于固相合成的多孔树脂制备方法，其特征在于，所述水相中分散剂的重量百分比为0.1
‑
5％，无机盐的重量百分比不超过20％；所述油相和水相的重量比为1:3
‑
1:20；所述油相中单乙烯基化合物占单体总量的重量百分比为40
‑
95.9％；所述油相中交联单体占单体总量的重量百分比为2
‑
20％；所...

【专利技术属性】
技术研发人员：王朝阳，张赪，吴丹，赵伟杰，李延军，刘琼，寇晓康，
申请(专利权)人：高陵蓝晓科技新材料有限公司，
类型：发明
国别省市：