一种提高蚕茧中丝素蛋白含量的转基因方法及其家蚕品种技术

本发明专利技术提供一种提高蚕茧中丝素蛋白含量的转基因方法及其家蚕品种，提高蚕茧中丝素蛋白含量的转基因方法通过GAL4/UAS系统，分别构建了在家蚕后部丝腺中特异性过表达BmDimm和特异性敲除BmYki和BmSd，均获得了后部丝腺增大的转基因家蚕；通过在家蚕后部丝腺中特异性敲除BmYki能提高家蚕的丝素蛋白含量，或通过在家蚕后部丝腺中特异性敲除BmSd能提高家蚕的丝素蛋白含量，或通过在家蚕后部丝腺中特异性过表达BmDimm能提高家蚕的丝素蛋白含量。本发明专利技术根据家蚕基因组序列数据库中家蚕丝腺表达内源基因的序列密码子偏好性，对Cas9蛋白的基因序列进行了优化设计，使Cas9基因更有利于在家蚕个体丝腺中表达；通过GAL4/UAS系统及CRISPR/Cas9基因编辑技术对家蚕丝腺进行了组织特异性的敲除和过表达。织特异性的敲除和过表达。织特异性的敲除和过表达。

【技术实现步骤摘要】
一种提高蚕茧中丝素蛋白含量的转基因方法及其家蚕品种


[0001]本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种提高蚕茧中丝素蛋白含量的转基因方法及其家蚕品种。

技术介绍

[0002]家蚕是一种重要的经济昆虫和鳞翅目模式昆虫。在长达五千多年的饲养驯化过程中，家蚕蚕丝产量的提高主要是通过传统杂交育种的方法来实现，存在着育种周期长、操作复杂、优良性状获得越来越难等技术挑战。随着家蚕全基因组测序的完成，标志人类对家蚕的研究和认识开始进入基因改造时代，利用高效稳定的转基因技术从基因组水平对家蚕的经济性状进行遗传改良是一种简单快捷的技术手段。
[0003]CRISPR/Cas是一种来自细菌免疫病毒DNA入侵的免疫机制，其中以CRISPR/Cas9系统应用最为广泛。Cas9蛋白可与gRNA结合成复合物，然后通过与基因组中的PAM序列结合形成发夹结构，进而对目的DNA双链进行切割，使DNA双链断裂，随后这种DNA的损伤可以启动细胞内的修复机制，主要包括两种途径：一是通过非同源末端连接途径进行修复，此修复机制会导致碱基的缺失或插入，从而造成移码突变，最终实现基因敲除；二是在提供外源修复模板的情况下，通过同源修复对DNA断裂位置进行修复，利用这种机制可以实现目的基因的精确编辑。
[0004]家蚕全基因组序列中存在大量的PAM序列，理论上可对家蚕所有基因进行敲除和编辑。但目前在家蚕中还未实现组织特异性的敲除。

技术实现思路

[0005]基于现有技术中存在的技术问题，本专利技术提供一种提高蚕茧中丝素蛋白含量的转基因方法及其家蚕品种。
[0006]依据本专利技术的技术方案的第一方面，提供一种提高蚕茧中丝素蛋白含量的转基因方法，其通过GAL4/UAS系统，分别构建了在家蚕后部丝腺中特异性过表达BmDimm和特异性敲除BmYki和BmSd，均获得了后部丝腺增大的转基因家蚕；通过在家蚕后部丝腺中特异性敲除BmYki能提高家蚕的丝素蛋白含量，或通过在家蚕后部丝腺中特异性敲除BmSd能提高家蚕的丝素蛋白含量，或通过在家蚕后部丝腺中特异性过表达BmDimm能提高家蚕的丝素蛋白含量。
[0007]具体为，通过改造的GAL4/UAS高效双元表达系统以及CRISPR/Cas9(Cas9蛋白的基因序列(SEQ ID NO.1)是根据家蚕密码子的偏好性进行了优化)，在家蚕后部丝腺中特异性过表达BmDimm(SEQ ID NO.2)和特异性敲除BmYki(SEQ ID NO.3)和BmSd(SEQ ID NO.4)基因导致后部丝腺器官增大，丝素蛋白合成量增加并能正常吐丝结茧。
[0008]其中，通过在家蚕后部丝腺中特异性敲除BmYki能提高家蚕的丝素蛋白含量的方法，其包括以下步骤：
[0009]步骤S1、GAL4表达载体构建；
[0010]步骤S2、敲除BmYki的UAS表达载体构建；
[0011]步骤S3、PSG中特异性敲除BmYki的转基因蚕的制作；
[0012]步骤S4、通过对PSG中特异性敲除BmYki的转基因蚕的5L6D丝腺进行形态学观察，并用相机拍摄照片；
[0013]步骤S5、通过对PSG中特异性敲除BmYki的转基因蚕的茧壳进行形态学观察，并用相机拍摄照片留证和验证；
[0014]步骤S6、通过对PSG中特异性敲除BmYki的转基因蚕的5L6D丝腺进行DNA提取，提取成功的DNA根据敲除位点设计的引物进行PCR扩增，扩增结果进行核酸电泳。
[0015]进一步地，通过在家蚕后部丝腺中特异性敲除BmSd能提高家蚕的丝素蛋白含量的方法，其包括以下步骤：
[0016]步骤S1、GAL4表达载体构建；
[0017]步骤S2、敲除BmSd的UAS表达载体构建；
[0018]步骤S3、PSG中特异性敲除BmSd的转基因蚕的制作；
[0019]步骤S4、通过对PSG中特异性敲除BmSd的转基因蚕的5L6D丝腺进行形态学观察，并用相机拍摄照片留证和验证；
[0020]步骤S5、通过对PSG中特异性敲除BmSd的转基因蚕的茧壳进行形态学观察，并用相机拍摄照片留证和验证；
[0021]步骤S6、通过对PSG中特异性敲除BmSd的转基因蚕的5L6D丝腺进行DNA提取，提取成功的DNA根据敲除位点设计的引物进行PCR扩增，扩增结果进行核酸电泳。
[0022]优选地，通过在家蚕后部丝腺中特异性过表达BmDimm能提高家蚕的丝素蛋白含量的方法，其包括以下步骤：
[0023]步骤S1、GAL4表达载体构建；
[0024]步骤S2、过表达BmDimm的UAS表达载体构建；
[0025]步骤S3、PSG中特异性过表达BmDimm的转基因蚕的制作；
[0026]步骤S4、通过对PSG中特异性过表达BmDimm的转基因蚕的5L6D丝腺进行形态学观察，并用相机拍摄照片留证和验证；
[0027]步骤S5、通过对PSG中特异性过表达BmDimm的转基因蚕的茧壳进行形态学观察，并用相机拍摄照片留证和验证；
[0028]步骤S6、通过对PSG中特异性过表达BmDimm的转基因蚕的5L6D丝腺进行DNA提取，提取成功的DNA根据BmDimm位点设计引物进行PCR扩增，扩增结果进行核酸电泳，进行基因组鉴定。
[0029]另外地，GAL4表达载体构建：构建了家蚕后部丝腺特异激活表达的GAL4载体，即以丝素蛋白重链fibH为启动子，GAL4蛋白结合结构域的基因序列为目的基因的GAL4表达载体。
[0030]其中，敲除BmYki的UAS表达载体构建：依次将10
×
UAS序列、根据家蚕密码子偏好进行优化的编码Cas 9蛋白序列、U6启动子序列、两个BmYki敲除靶点、Ser1
‑
polyA为终止信号等多个序列进行串联形成目的基因表达框，随后将目的基因表达框插入到piggyBac载体骨架上即pBac[3
×
P3
‑
ECFP]上并命名为敲除BmYki。
[0031]优选地，通过胚胎显微注射及荧光筛选获得对应的HG4转基因家蚕和UAS转基因家
蚕，通过将两者进行两两杂交，筛选眼睛即发红色荧光也发绿色荧的转基因家蚕。
[0032]进一步地，敲除BmSd的UAS表达载体构建：依次将10
×
UAS序列、根据家蚕密码子偏好进行优化的编码Cas 9蛋白序列、U6启动子序列、两个BmSd敲除靶点、Ser1
‑
polyA为终止信号等多个序列进行串联形成目的基因表达框，随后将目的基因表达框插入到piggyBac载体骨架上即pBac[3
×
P3
‑
ECFP]上并命名为敲除BmSd。
[0033]更进一步地，过表达BmDimm的UAS表达载体构建：依次将10
×
UAS序列、BmDimm为目的基因、Ser1
‑
polyA为终止信号等多个序列进行串联本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高蚕茧中丝素蛋白含量的转基因方法，其特征在于，其通过GAL4/UAS系统，分别构建了在家蚕后部丝腺中特异性过表达BmDimm和特异性敲除BmYki和BmSd，均获得了后部丝腺增大的转基因家蚕；通过在家蚕后部丝腺中特异性敲除BmYki能提高家蚕的丝素蛋白含量，或通过在家蚕后部丝腺中特异性敲除BmSd能提高家蚕的丝素蛋白含量，或通过在家蚕后部丝腺中特异性过表达BmDimm能提高家蚕的丝素蛋白含量。2.依据权利要求1所述的提高蚕茧中丝素蛋白含量的转基因方法，其特征在于，通过在家蚕后部丝腺中特异性敲除BmYki能提高家蚕的丝素蛋白含量的方法，其包括以下步骤：步骤S1、GAL4表达载体构建；步骤S2、敲除BmYki的UAS表达载体构建；步骤S3、PSG中特异性敲除BmYki的转基因蚕的制作；步骤S4、通过对PSG中特异性敲除BmYki的转基因蚕的5L6D丝腺进行形态学观察，并用相机拍摄照片；步骤S5、通过对PSG中特异性敲除BmYki的转基因蚕的茧壳进行形态学观察，并用相机拍摄照片留证和验证；步骤S6、通过对PSG中特异性敲除BmYki的转基因蚕的5L6D丝腺进行DNA提取，提取成功的DNA根据敲除位点设计的引物进行PCR扩增，扩增结果进行核酸电泳。3.依据权利要求1所述的提高蚕茧中丝素蛋白含量的转基因方法，其特征在于，通过在家蚕后部丝腺中特异性敲除BmSd能提高家蚕的丝素蛋白含量的方法，其包括以下步骤：步骤S1、GAL4表达载体构建；步骤S2、敲除BmSd的UAS表达载体构建；步骤S3、PSG中特异性敲除BmSd的转基因蚕的制作；步骤S4、通过对PSG中特异性敲除BmSd的转基因蚕的5L6D丝腺进行形态学观察，并用相机拍摄照片留证和验证；步骤S5、通过对PSG中特异性敲除BmSd的转基因蚕的茧壳进行形态学观察，并用相机拍摄照片留证和验证；步骤S6、通过对PSG中特异性敲除BmSd的转基因蚕的5L6D丝腺进行DNA提取，提取成功的DNA根据敲除位点设计的引物进行PCR扩增，扩增结果进行核酸电泳。4.依据权利要求1所述的提高蚕茧中丝素蛋白含量的转基因方法，其特征在于，通过在家蚕后部丝腺中特异性过表达BmDimm能提高家蚕的丝素蛋白含量的方法，其包括以下步骤：步骤S1、GAL4表达载体构建；步骤S2、过表达BmDimm的UAS表达载体构建；步骤S3、PSG中特异性过表达BmDimm的转基因蚕的制作；步骤S4、通过对PSG中特异性过表达BmDimm的转基因蚕的5L6D丝腺进行形态学观察，并用相机拍摄照片留证和验证；步骤S5、通过对PSG中特异性过表达BmDimm的转基因蚕的茧壳进行形态学观察，并用相机拍摄照片留证和验证；步骤S6、通过对PSG中特异性过表达BmDimm的转基因蚕的5L6D丝腺...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐汉福，曾文慧，欧瑶，罗琴，刘荣鹏，马艳，马静文，唐艺芸，胡杰，陈玉琴，向仲怀，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：