用于提高生物测定动态范围的方法技术

本发明专利技术涉及用于提高生物测定动态范围的方法。提供扩展生物测定诸如免疫测定的范围的组合物和方法。在一个实施方式中，使用多个离散测试位点。收集指示存在所关注的分析物的测试位点比例的数据和为由离散测试位点群体生成的信号提供统计值的数据。聚集这些数字和统计方法的结果以提供扩展的动态范围。在另一个实施方式中，以连续方式向单个测试位点或容器提供两次或更多次试剂添加。此类添加呈现相同样品的不同稀释度的不同试剂组，并且允许在单个多重测定中同时表征高丰度分析物和低丰度分析物两者，同时避免在低样品稀释度下观察到高丰度分析物的高剂量钩状效应。可组合这些方法以提供动态范围的进一步提高。法以提供动态范围的进一步提高。

【技术实现步骤摘要】
用于提高生物测定动态范围的方法
[0001]本申请为分案申请，原申请的申请日为2018年09月06日、申请号为“201811035838.9”、专利技术名称为“用于提高生物测定动态范围的方法”。
[0002]本申请要求2017年9月6日提交的美国临时申请No.62/554,889的权益。这些和所有其它参考外来材料通过引用整体并入本文。当通过引用并入的参考文献中术语的定义或使用与在本文中提供的术语的定义不一致或相反时，以在本文中提供的此术语的定义为主。


[0003]本专利技术的领域是生物测定，特别是免疫测定。

技术介绍

[0004]
技术介绍
描述包括可用于理解本专利技术的信息。这并非承认本文所提供的任何信息是现有技术或与当前要求保护的专利技术相关，或者具体地或隐含地引用的任何出版物是现有技术。
[0005]生物测定，诸如免疫测定(例如，EIA、FIA等)、核酸扩增测定(诸如rtPCR、线性扩增测定等)和基于细胞的测定是现代生物研究和临床实践的支柱。历史上，这些生物测定已经通过用分析物特异性试剂处理样品并且从本体混合物(bulk mixture)获得信号强度(例如，吸光度、荧光强度、发光强度等)的读数来进行。将此信号强度与从由用相同试剂处理的类似样品制备的本体混合物获得的信号强度的标准或剂量/响应曲线进行比较，以便导出所关注的分析物的浓度。在免疫测定的情况下，此类分析物特异性试剂通常包括与所关注的分析物形成特异性、可检测的复合物的抗体或抗体片段。此类免疫测定的动态范围一般限于约两个数量级。然而，在一些应用中，分析物的浓度范围可能扩展超出此范围。类似地，在多重测定中，各分析物的浓度范围可宽泛地变化。
[0006]已经尝试开发具有扩展的测量或动态范围的生物测定。例如，Bell的美国专利No.6,551,788描述基于荧光的免疫测定，其中不同尺寸的颗粒被用作初始捕获相。该专利陈述，大颗粒比小颗粒在低浓度下提供分析物分子的更有效捕获；遗憾的是，它没有提供理论框架或数据来支持此断言。
[0007]Goix等人的美国专利申请No.2014/0065722描述某种程度类似的方法，其中不同的颗粒群体与针对相同分析物的低亲和力抗体或高亲和力抗体偶联并且被用作捕获相。分开读取不同的颗粒群体以产生可用于提供扩展的测量范围的有区别的剂量/响应曲线。Dowell等人的美国专利申请公开No.2015/0046114描述类似的方法，其中共同捕获抗体与夹心免疫测定中对分析物具有不同亲和力的不同标记抗体组合使用。然而，这些方法需要具有相同特异性和显著不同亲和力的抗体的可用性，这可能不适用于所关注的分析物。
[0008]在另一种方法中，已经提出使用并入对所关注的分析物具有不同结合亲和力的物理上有区别的区或传感器的测试装置。例如，(Campbell等人的)美国专利No.9,671,398描述使用两种不同的免疫传感器，一种免疫传感器被构建用于展示分析物相对于另一种分析
物的结合的减弱，以导出提供有效的扩展测量范围的重叠剂量/响应曲线。然而，此类装置的构建是复杂的，并且在应用于多重测定时变得越来越复杂。
[0009]在Drukier的美国专利No.7604956中描述的另一种方法中，通过系统地减少在其它常规测定中的背景噪声源来实现扩展的测量范围。这种背景噪声的减少有效地增加测定的灵敏度，而不影响高分析物浓度下的测定性能，从而导致动态范围增加。然而，尚不清楚用于最小化背景噪声源的方法是否适用于宽范围的生物测定。另外，由于最小化背景噪声源的方法对于每种分析物是特定的，所以这种方法似乎不太可能可用于多重测定。
[0010]在(Talebpour和Leanord的)美国专利No.7723127中描述的又另一种方法中，使用向捕获试剂中多次添加含有所关注的分析物的样品进行免疫测定。后一个添加使用稀释捕获试剂的大体积进行。得到的复合剂量/响应曲线介于使用小的初始样品体积或作为单次推注施加的总样品体积生成的剂量/响应曲线之间。然而，虽然这被定位为提供具有扩展动态范围的剂量/响应曲线，但是所提供的比较数据与由单次添加提供的复合剂量/响应曲线相比示出对更广泛范围的分析物浓度的显著响应。报告的扩展测量范围似乎是使用非常规计算最小可检测剂量的结果，该最小可检测剂量基于为最大观察信号的10％的信号选择此值，而不是区分观察到的信号与用空白样品实现的信号的能力。
[0011]最近，已经进行各种技术以利用在此类测定中编码单独出现的结果的能力，尤其是在多重测定的情况下。例如，可使用二维表面微阵列(其提供单独的结果的位置编码)或微观珠的悬浮阵列(其可使用与用于提供分析物特异性结果的染料、荧光团等不同的染料、荧光团等编码)进行多重免疫测定。此类方法通常用于多重测定，因为结果的编码提供用于区分在同一样品上同时进行的不同测定的结果的手段。然而，即使没有多重性(multiplexing)，从此类编码结果中导出量化结果也是具有挑战性的。为了适当地缩放，通常在相对小且离散的区域——例如单独的微珠的表面或微阵列上的单独的印刷“点”——上提供单独的代码结果。历史上，单一离散编码结果的分析尚未提供足够精确的量化结果。已经对来自多个离散编码结果的聚集数据应用统计方法，以提供量化。
[0012]在一种方法中，测量来自大量单独的离散测试区域的信号强度并且该信号强度用于生成对强度值的频率分布。通常地，分布的平均值或中值被用作与此样品的分析物浓度相关联的值。例如，(Ruan等人的)美国专利申请No.2012/0308997描述其中使用颗粒群体进行免疫测定的方法。来自测试颗粒的信号强度的分布被用于计算平均信号强度，该平均信号强度继而用于导出测试样品中分析物的浓度。本文中的所有出版物均以相同程度通过引用并入，如同每个单独的出版物或专利申请都具体地并单独地指出通过引用并入一样。当并入的参考文献中术语的定义或用法与在本文中提供的此术语的定义不一致或相反时，应用在本文中提供的此术语的定义，而不应用在参考文献中此术语的定义。然而，在此类方法中，测定灵敏度基本上是在此分布内发现的平均信号强度和变化(即信噪比)两者。由于在低分析物浓度下的信噪比较低，所以使用此方法的测定灵敏度必然受到限制。
[0013]在另一种方法中，将单独的离散测试区域以二元方式分类为“阳性”(即指示存在分析物)或阴性(即指示不存在分析物)。在此类“数字”方法中，利用阳性测试区域与阴性测试区域的相对比例来导出此样品的分析物浓度，这通常地通过与使用含有已知分析物浓度的样品生成的剂量/响应曲线比较进行。例如，(Shim等人的)英国专利No.2510653描述一种方法，其中基于酶活性，将使用测试样品制备的油:水乳液中的单独的飞滴分类为含有β
‑
半
乳糖苷酶标记或不含有β
‑
半乳糖苷酶标记。存在于测试样品中的β
‑
半乳糖苷酶标记的量由从单层此类液滴的图像确定的阳性飞滴和阴性飞滴的比率来确定。类似地，(Shim的)美国专利申请公开No.2015/0293102描述在飞滴悬本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于提高生物结合测定的动态范围的方法，所述方法包括：使包含第一捕获分子的第一测试表面与第一体积的样品接触，其中所述样品包含结合所述第一捕获分子的第一靶分子和第二靶分子，并且其中所述第一体积包括第一样品稀释度；将所述第一测试表面和所述样品温育第一段时间，所述第一段时间足以形成包含所述第一捕获分子和所述第一靶分子的第一复合物；将包含第二测试表面的第二体积添加到所述第一体积中，从而生成第二样品稀释度，其中所述第二测试表面包含第二捕获分子，并且其中所述第二体积超过所述第一体积；将所述第二测试表面和所述样品温育第二段时间，所述第二段时间足以形成包含所述第二捕获分子和所述第二靶分子的第二复合物；以及从所述第一复合物获得第一信号，并且从所述第二复合物获得第二信号。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一测试表面包含第一微粒群体，并且所述第二测试表面包含第二微粒群体。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二靶分子以超过所述第一靶分子的浓度存在于所述样品中。4.根据权利要求1所述的方法，包括在获得所述第一信号和第二信号之前洗涤所述第一测试表面和第二测试表面的附加步骤。5.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：Y，
申请(专利权)人：阿姆普勒斯生物科学公司，
类型：发明
国别省市：