一种通过miR-145筛选高产肉率碱地黑牛的方法技术

本发明专利技术属于生物育种技术领域，提供了一种miR

【技术实现步骤摘要】
一种通过miR
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145筛选高产肉率碱地黑牛的方法


[0001]本专利技术属于生物育种
，具体涉及miR
‑
145的新应用。

技术介绍

[0002]骨骼肌的肌纤维作为畜禽肉类食品的重要组成部分，肌纤维的性质也是影响其肉品质的重要因素。因此，在产肉动物育种过程中，研究骨骼肌的调控机制可以对提高畜禽产肉量以及改善肉品质有一定的指导意义。
[0003]miRNA（microRNA）是小分子非编码单链RNA，长度在22个核苷酸左右，目前发现的miRNA 近40000种。miRNAs广泛存在于多种真核生物中，miRNAs在生物体的细胞增殖、分化、凋亡等生物过程中起到广泛的调控作用，对生物体的生长发育有十分重要的影响。有研究表明，miR
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145可以抑制缺氧诱导的小鼠的心肌细胞凋亡，减小缺血再灌注损伤导致的心肌梗死面积。根据以往研究表明，miR
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145通过抑制靶基因FSCN1的表达来抑制成肌细胞C2C12的分裂增殖。有研究发现，miR
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145在猪背最长肌中，随着年龄的增长表达量逐渐上升。冯阳等人揭示出miR
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145在肌纤维形成过程中的差异表达情况，为进一步研究miR
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145在骨骼肌发育过程中的功能提供了一定的依据。这说明miR
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145对肌肉的生长发育具有一定的调控作用。
[0004]肌钯蛋白（MYPN）是2001年被发现的一个145 KD并广泛分布于骨骼肌和心肌中的肌节蛋白，其结构与普遍表达的肌动蛋白相关蛋白PALLD相似，它是通过标记辅助选择进行肉质选择的重要候选基因。MYPN的功能类似于脚手架，可以将脊椎动物Z线中的半肌动蛋白和α
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辅肌动蛋白结合起来，α
‑
辅肌动蛋白又直接与细肌丝相结合构成Z线内部网络。有研究表明，过表达MYPN的心脏锚蛋白重复序列（CARP）结合区域会使肌节蛋白的组分遭到严重的破坏，说明其表达有可能是通过MYPN和CARP的相互作用而使得肌纤维组织与肌肉基因存在关联；并且有关MYPN的研究主要集中于其对人类肌病的作用，如线状体肌病、渐进性肌无力、肾上腺素肌病等，并且有研究表明，MYPN突变可能导致肌张力降低和扩张型心肌病。在产肉动物上，有研究表明MYPN基因3
’
非编码区的一段序列AJ560657的231、298、318碱基处有3个SNP，通过对其进行肉质性状关联性分析，证明MYPN可作为影响猪肉质性状的候选基因。还有研究表明牛MYPN的A1795G SNP与牛的眼肌面积和系水力显著相关。Silvia等通过对不同品种猪进行了MYNP的SNP和胴体性状的关联研究，结果发现其可影响骨骼肌沉积和肉类生产特性。
[0005]山东胜伟集团是在盐碱地领域深耕实践的基础上，立足于盐碱地复育和肉牛良种繁育两大优势，在全国首创“盐碱地安格斯肉牛产业园”模式。碱地黑牛是山东胜伟集团与国际肉牛繁育机构联合，通过筛选世界顶级安格斯肉牛基因，培育研发出的适应盐碱地的高端肉牛品种，该品种牛具有生长发育快，早熟，易肥育，易配种，肉质好，出肉率高，对环境适应能力强，分娩难产率低等特点，是生产大理石纹牛肉的优秀牛种。

技术实现思路

[0006]针对现有技术中的问题，本专利技术提供一种bta
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miR
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145在调节MYPN基因表达中的应用。
[0007]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案。
[0008]一种miR
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145在碱地黑牛育种中的应用。
[0009]所述应用为筛选miR
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145含量低的个体作为高产肉率肉牛。
[0010]一种miR
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145在调节MYPN基因表达中的应用。
[0011]优选地，所述应用为将含miR
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145模拟物（mimics）或抑制剂（inhibitor）的载体转染靶细胞。
[0012]优选地，所述载体包括但不限于慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、脂质体和构建病毒的质粒。
[0013]优选地，所述靶细胞选自碱地黑牛的体细胞、受精卵、细胞系。
[0014]本专利技术具有以下优点：本专利技术通过试验证明miR
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145可以调节碱地黑牛骨骼肌的增殖和生长，还能调节MYPN基因的表达。miR
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145能够通过抑制MYPN的表达，影响碱地黑牛肌肉细胞的增殖和生长，从而影响肉质的生长，在育种中应筛选miR
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145含量低的个体作为高产肉率肉牛。本专利技术为优质肉牛的育种提供了新的方向。
附图说明
[0015]图1是差异miRNA聚类分析图和bta
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miR
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145在背肌中的表达量；图2是碱地黑牛骨骼肌细胞诱导分化过程（2d、3d、4d、5d）；图3是Edu检测细胞增殖；图4是MYPN和GAPDH基因熔解曲线（上）和扩增曲线（下）和MYPN基因在碱地黑牛不同组织的表达量分析；图5是双荧光素酶报告基因检测bta
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miR
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145与MYPN
‑3’
UTR相互作用；图6是免疫荧光检测MYPN表达量。
具体实施方式
[0016]下面结合实施例和附图对本专利技术做进一步说明，但本专利技术不受下述实施例的限制。
[0017]实施例1差异miRNA筛选选取12月龄碱地黑牛和鲁西黄牛各4头，采背最长肌组织置于液氮保存。分别用Trizol试剂（Invitrogen）提取总RNA。当RIN≥7.0且28S/18S≥0.7时，表示提取的RNA质量合格。本研究样品RIN均在7.3之上，OD
260/280
的比值均在0.8
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2.0的范围内，说明提取的RNA完整性好，纯度高，可用于后续的文库构建。
[0018]将RNA样品构建序列文库：使用Illumina基因组分析仪系统测序后，构建sRNA文库。通过比对分析软件Bowtie（设置允许一个错配）将sRNA测序的cleanreads定位到参考基因组上，共获得26061624个cleanreads；与miRBase数据库的牛物种的参考序列进行比较，匹配到已知miRNA上的Total和UniqueCleanReads的总数量分别为29849254和37946。
[0019]表1差异表达的miRNA根据差异miRNA筛选标准：|log2(Fold_change)|≥1且Q≤0.05，获得差异表达的miRNA71个（表1），其中上调39个，下调32个（图1A）。根据TPM（TranscriptsPerMillion）筛选出碱地黑牛和鲁西黄牛中表达量有差异的miRNA为miR
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145（图1B）。
[0020]实施例2miR
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145对碱地黑牛骨骼肌细胞分化和增殖的影响将5本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种miR
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145在碱地黑牛育种中的应用，其特征在于，所述应用为筛选miR
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145含量低的个体作为高产肉率肉牛。2.一种miR
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145在调节MYPN基因表达中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用为将含miR...

【专利技术属性】
技术研发人员：董雅娟，刘瑞莉，王胜，韩明轩，于堃，张文琦，陈振鹏，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：