一种低成本快速去除DNA合成中错误的方法技术

本发明专利技术提供了一种用于除去合成的DNA样品中合成的有错误的DNA的方法，其中，所述方法使用TaqMutS和纤维素结合域的融合蛋白结合所述合成的有错误的DNA，并使用纤维素包被的磁珠去除所述合成的有错误的DNA。本发明专利技术将纤维素包被磁珠与错配结合蛋白二者进行组合，建立一种可用于DNA合成中有错DNA高效去除的方法。在该方法中，磁珠制备简单，材料成本低，错配结合蛋白的结合快速简便，对于有错DNA的去除快速有效。有效。

【技术实现步骤摘要】
一种低成本快速去除DNA合成中错误的方法


[0001]本专利技术涉及到生物
具体地，涉及通过构建一种纤维素包被的磁珠，快速结合错配结合蛋白(MutS)
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纤维素结合域融合蛋白，去除与MutS结合的有错配的DNA。本专利技术可用于降低DNA合成中的错误，提高DNA合成效率，降低DNA合成成本。

技术介绍

[0002]随着合成生物学的发展，对DNA从头合成的需求越来越大。DNA的从头合成通常先合成寡核苷酸，再将寡核苷酸组装成1Kb左右的DNA片段。需要更长的DNA时，可以通过将1Kb的DNA进一步组装获得。传统的寡核苷酸的合成方法采用的是在多空玻璃柱或其他材料上的固相亚磷酰胺三酯法合成，技术比较成熟，产量相对较大，但电使得成本较高。新型的基于芯片的高通量原位寡核苷酸合成技术是一类高通量并行合成寡核苷酸的技术，该技术可以在一张芯片上合成数千，甚至数万种不同的寡核苷酸，可以极大的降低单种寡核苷酸的合成成本(王冬梅et al.，2012)。但是由于寡核苷酸合成过程中难免会有错误，而芯片合成的寡核苷酸错误率更高，DNA合成中的错误去除或纠正就尤为重要。
[0003]DNA合成中错误去除的方法有两大类，即核酸酶切除法和错配结合蛋白(MutS)结合法(王冬梅et al.，2012)。当将DNA进行变性退火以后，正确和错误的DNA之间会形成错配，以上两种方法都可以将有错配的DNA去除。核酸酶法是通过一类能识别错配的核酸酶，找到DNA错配部分，并将其切断一条链，再切去错配的碱基，处理过的DNA可以通过DNA组装和扩增获得错误率大幅度降低的DNA片段。而错配结合蛋白方法，一般采用MutS结合有错配的DNA，再将MutS和有错配DNA复合物去除，获得无错DNA。上述两种方法，由于技术原因都不可能完全去除有错DNA。
[0004]错配结合蛋白结合法只需一种蛋白，而核酸酶法常常需要两种以上酶，因此，错配结合蛋白法更简单一些。错配结合蛋白结合错配DNA后与无错DNA的分离可以通过电泳分离(Carr et al.，2004)或固定化MutS的分离，并且已有报道证明通过MutS的方法，获得完全正确的DNA的比例比其他方法高(Lubock et al.，2017)。电泳方法相对麻烦，步骤多，而固定化法相对快捷、简便。固定MutS也有报道采用磁珠法，但是磁珠法中的磁珠需要进行链霉亲和素交联，价格昂贵，蛋白需要生物素标记，整个固定化过程繁琐(Geschwind et al.，1996)。本专利技术人前期建立了与纤维素结合域融合重组表达MutS蛋白，可以快速简便地将MutS融合蛋白固定到纤维素上，填充成纤维素柱进行DNA合成错误去除的方法，可大幅度降低成本(Wan et al.，2014；Wan et al.，2017)。该方法已经在大规模芯片合成的寡核苷酸的错误去除中证明有效，但是该方法不足之处是需要的DNA量相对较大，而且操作进行的体积较大(0.5mL)。
[0005]本专利技术将利用纤维素结合域在纤维素上的固定化的便利性，同时依据多糖包被磁珠制作方法，制作多糖包被的磁珠，然后将两者结合起来，建立一种小体积的快速DNA错误去除方法，并且以从头合成GFP基因DNA过程中的错误去除为例进行验证。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是建立一种低成本、简便、快速的方法去除DNA合成中的错误，降低DNA合成成本，减小反应体积，为将来在自动化设备上应用做准备。
[0007]本专利技术的
技术实现思路
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[0008]本专利技术中将栖热水生菌的错配结合蛋白MutS(TaqMutS)或大肠杆菌的错配结合蛋白MutS(EcoMutS)与纤维素结合域3(CBM3)融合表达；而需要纠错的DNA样本通过变性退火从而将合成错误的碱基展示为错配碱基；再利用融合蛋白中的MutS蛋白特异性识别并结合含有错配碱基对的双链DNA的能力，可以将这些有错误碱基的DNA双链结合到融合蛋白中的MutS上；再通过纤维素包被的磁珠与融合蛋白中的纤维素结合域3结合，从而与结合有错配DNA的MutS融合蛋白结合，在移除磁珠的同时将有错配DNA和MutS融合蛋白同时除去，从而实现去除含有错误的DNA的目标(其原理参见图1)。在本专利技术的方法中，先进行了含有错配的59bp的双链DNA的测试，意外发现并非所有融合蛋白均有效，其中仅TaqMutS融合蛋白有效，而EcoMutS融合蛋白无效。在此基础上通过合成绿色荧光蛋白的基因(GFP)进行了测试，证明EcoMutS融合蛋白有效，使错误率从3.01个/Kb降到了0.62个/Kb.
[0009]本专利技术涉及以下技术方案：
[0010]1、用于除去合成的DNA样品中合成的有错误的DNA的方法，其中，所述方法使用TaqMutS和纤维素结合域的融合蛋白结合所述合成的有错误的DNA，并使用纤维素包被的磁珠去除所述合成的有错误的DNA。
[0011]2、根据项目1所述的方法，其中，在所述使用TaqMutS和纤维素结合域的融合蛋白结合所述合成的有错误的DNA的步骤中，将所述TaqMutS和纤维素结合域的融合蛋白与所述DNA样品混合，并常温放置。
[0012]3、根据项目2所述的方法，其中，所述常温放置持续时间为至少10分钟。
[0013]4、根据项目1所述的方法，其中，在所述使用纤维素包被的磁珠去除所述合成的有错误的DNA的步骤中，将所述纤维素包被的磁珠添加到样品中，并用磁铁吸附磁珠，从而去除合成的有错误的DNA。
[0014]5、根据项目1所述的方法，其中所述TaqMutS和纤维素结合域的融合蛋白的序列如SEQ ID NO：28所示。
[0015]6、根据项目1所述的方法，其中所述纤维素包被的磁珠的制备方法包括：将六水氯化铁溶于乙二醇中，然后加入醋酸钠和微晶纤维素并搅拌，加热，然后冷却并收集。
[0016]7、一种用于除去合成的DNA样品中合成的有错误的DNA的试剂盒，其包括TaqMutS和纤维素结合域的融合蛋白，和纤维素包被的磁珠。
[0017]8、根据项目7所述的试剂盒，其中所述TaqMutS和纤维素结合域的融合蛋白的序列如SEQ ID NO：28所示。
[0018]9、根据项目7所述的试剂盒，其中，所述纤维素包被的磁珠是通过以下制备的：将六水氯化铁溶于乙二醇中，然后加入醋酸钠和微晶纤维素并搅拌，加热，然后冷却并收集。
[0019]具体地，本专利技术包括以下内容：
[0020]1)将TaqMutS和EcoMutS的大肠杆菌重组表达菌株(专利ZL201410023235.2)活化，蛋白表达纯化后进行错配DNA结合能力的测试，确定有结合能力后用于本专利技术。
[0021]2)将FeCl3，乙二醇和微晶纤维素混合后在200℃保温12h制备获得纤维素包被的
磁珠，然后用磁铁在离心管外吸附磁珠，用纯水洗涤两次，最后加20％乙醇重悬，保存。
[0022]3)将第一项中的TaqMutS或EcoMutS与有错配的DNA结合，并用磁珠拉去MutS和结合的DNA，检本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于除去合成的DNA样品中合成的有错误的DNA的方法，其中，所述方法使用TaqMutS和纤维素结合域的融合蛋白结合所述合成的有错误的DNA，并使用纤维素包被的磁珠去除所述合成的有错误的DNA。2.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述使用TaqMutS和纤维素结合域的融合蛋白结合所述合成的有错误的DNA的步骤中，将所述TaqMutS和纤维素结合域的融合蛋白与所述DNA样品混合，并常温放置。3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述常温放置持续时间为至少10分钟。4.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述使用纤维素包被的磁珠去除所述合成的有错误的DNA的步骤中，将所述纤维素包被的磁珠添加到样品中，并用磁铁吸附磁珠，从而去除合成的有错误的DNA。5.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：洪泂，贾丽婷，王和乔，王冬梅，
申请(专利权)人：中国科学技术大学，
类型：发明
国别省市：