一种检测谷氨酸脱羧酶抗体各亚型的试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种检测谷氨酸脱羧酶抗体各亚型的试剂盒，属于生物医药技术领域。所述检测试剂盒包括以下试剂：谷氨酸脱羧酶抗原蛋白，Sulfo

【技术实现步骤摘要】
一种检测谷氨酸脱羧酶抗体各亚型的试剂盒


[0001]本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种检测谷氨酸脱羧酶抗体各亚型的电化学发光法检测试剂盒。

技术介绍

[0002]1型糖尿病(T1DM)胰岛自身抗体包括胰岛素自身抗体(IAA)、谷氨酸脱羧酶抗体(GADA)、酪氨酸磷酸酶抗体(IA2A)和锌转运体8自身抗体(ZnT8A)，是目前T1DM胰岛β细胞自身免疫破坏的最可靠生物标志，对胰岛自身抗体进行检测有助于了解T1DM的自身免疫病程，并对T1DM患者的诊断、鉴别诊断，以及一般人群和患者一级亲属的风险预测有极大的价值。GADA作为占比较高的胰岛自身抗体，在T1DM的鉴别诊断中具有特殊的地位，不仅可以揭示病人的免疫进程，还可能为病人的精准化治疗带来新的思路。
[0003]一直以来GADA的检测都是总的抗体的检测，没有类型上的细分，但不同的抗体亚型具有不同的生物学意义，其免疫源性存在差异，因此对抗体进行进一步的细分，进行亚型的鉴定，对于疾病作用机理的研究、药物的开发具有重要意义。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种检测谷氨酸脱羧酶抗体各亚型的电化学发光法检测试剂盒，填补了分型上的空白。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0006]一种检测谷氨酸脱羧酶抗体各亚型的试剂盒，包括以下试剂：谷氨酸脱羧酶抗原蛋白，Sulfo
‑
TAG，生物素标记的抗Ig各型的抗体和MSD链霉亲和素平板。
[0007]进一步地，所述生物素标记的抗Ig各亚型的抗体为生物素标记的抗IgG1的二抗、生物素标记的抗IgG2的二抗、生物素标记的抗IgG3的二抗、生物素标记的抗IgG4的二抗、生物素标记的抗IgA的二抗、生物素标记的抗IgD的二抗、生物素标记的抗IgM的二抗、生物素标记的抗IgE的二抗。
[0008]进一步地，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。
[0009]采用上述试剂盒检测胰岛素抗体亚型的方法，包括以下步骤：
[0010]步骤1，采用Sulfo
‑
TAG标记谷氨酸脱羧酶抗原蛋白；
[0011]步骤2，将步骤1的标记抗原制成抗原缓冲液；
[0012]步骤3，将抗原缓冲液与待测血清混合，然后加入生物素标记的抗Ig各亚型的抗体，混合后进行孵育；
[0013]步骤4，将步骤3的混合物置于MSD链霉亲和素平板，通过MSD电化学发光仪器检测发光计数，然后计算抗体指数。
[0014]本专利技术在已有ECL检测法的基础上，通过新的试剂的引入，以及原有试剂Biotin标记抗原的去除，使得待测抗体与各试剂形成全新的四个蛋白质分子的聚合物，不仅可以有效联通电路，放大检测信号，还可以实现抗体亚型的精准分型。
附图说明
[0015]图1为本专利技术检测试剂盒的检测原理。
[0016]图2为ECL
‑
GAD抗体的正常人界值判定结果。
[0017]图3为ECL
‑
GAD抗体及RBA检测GAD抗体结果的ROC曲线分析。
[0018]图4为ECL
‑
GAD抗体分型实验二抗浓度梯度实验结果。
[0019]图5为部分初诊糖尿病患者的ECL
‑
GAD抗体分型检测结果。
[0020]图6为对733名初诊糖尿病患者GAD抗体分别进行的ECL及RBA检测结果。
[0021]图7为对图6筛选出的ECL
‑
GAD阳性、RBA
‑
GAD阴性的患者进行GAD抗体分型结果。
具体实施方式
[0022]鉴于不同的抗体亚型的生物学意义，本专利技术在现有ECL的平台上建立了新的ECL
‑
GAD抗体检测方法，并与国际上检测谷氨酸脱羧酶抗体的金标准RBA法进行了比对；同时通过核心步骤的改变建立了谷氨酸脱羧酶抗体各亚型，包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD、IgM、IgE的ECL分类检测方法，使谷氨酸脱羧酶抗体在方法学的检测上摆脱了同位素的限制，填补了分型上的空白。为临床难以分型的糖尿病患者提供了新的诊断参考。
[0023]如图1所示，常规的ECL抗体检测在于使待测抗体分子的两个轻链结合携带不同信号的抗原分子，形成包含三个蛋白质分子的聚合物，继而联通电路，获得检测信号；而本专利技术通过采用生物素标记的抗Ig各亚型的抗体，使得待测抗体与各试剂形成了全新的四个蛋白质分子的聚合物，替换了原来的三个蛋白质分子的聚合物。新的四分子聚合物通过结构的全新改变介导了信号传导路径的改变，使检测信号得到了双倍的提升；同时实现了抗体亚型的精准分型，为临床诊疗带来了全新的提示。
[0024]下面结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步详细说明，但不应理解为对本专利技术的限制。在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本专利技术的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。
[0025]样本来源：GAD阳性质控血清标本来自于专利技术人实验室现有的经过国际胰岛自身抗体标准化检测(IASP)国际室间认证的RBA GAD检测技术平台使用的强阳性混合样本，阴性质控血清标本取自于无糖尿病家族史的健康志愿者。糖尿病(DM)血清150例来自2020年IASP组织室间质评样本、733例初诊糖尿病血清来自临床收集的初次诊断为DM的病人。健康人155例来自招募人群[年龄(26.8
±
9.7)岁；男87例，女68例]；糖耐量检测(OGTT)空腹及2h血糖正常,排除心、脑、肝、肾等慢性及内分泌疾病，无糖尿病家族病史及自身免疫疾病史。所有研究对象均签署知情同意。
[0026]实施例1
[0027]1.血清标本采集：
[0028]所有健康对照者和糖尿病患者均采集禁食8h以上的空腹肘静脉血，分离血清后于
‑
70℃冰箱中保存。
[0029]2.ECL
‑
GAD检测：
[0030]a.标记蛋白：GAD抗原蛋白按摩尔比1∶20分别与3mmol/L NHS
‑
PEG4
‑
Biotin(Thermo，A39259)和3mmol/L Sulfo
‑
TAG(Meso Scale Discovery，R91AO
‑
2)混合，室
温避光孵育1h后经Zeba柱(Thermo，89890)纯化过滤收集于无菌离心管，即为标记后的GAD
‑
Biotin和GAD
‑
Sulfo
‑
TAG。
[0031]b.抗原缓冲液准备：标记后GAD
‑
Biotin和GAD
‑
Sulfo
‑
TAG按800ng/mL，100ng/mL比例混合至含5％胎牛血清的1
×
磷酸盐缓冲液本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测谷氨酸脱羧酶抗体各亚型的试剂盒，其特征在于：包括以下试剂：谷氨酸脱羧酶抗原蛋白，Sulfo
‑
TAG，生物素标记的抗Ig各亚型的抗体和MSD链霉亲和素平板。2.根据权利要求1所示的检测试剂盒，其特征在于：所述生物素标记的抗Ig各亚型的抗体为生物素标记的抗IgG1的二...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈恒，顾愹，祁颜艳，张梅，郑旭琴，
申请(专利权)人：江苏省人民医院南京医科大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：