苹果β-半乳糖苷酶基因Mdβ-gal18及在调控果实成熟软化中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种苹果β

【技术实现步骤摘要】
苹果
β
‑
半乳糖苷酶基因Md
β
‑
gal18及在调控果实成熟软化中的应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及苹果β
‑
半乳糖苷酶基因Mdβ
‑
gal18及在调控果实成熟 软化中的应用。

技术介绍

[0002]质地是影响果实品质的重要指标，同时也是决定果实采后贮藏寿命的重要内在因子(Li 等，2010)，其中软化是果实采后质地变化最为常见的形式。苹果是典型的呼吸跃变型果实， 采后贮藏性虽优于桃、柿等水果，但不同品种间贮藏性差异很大：
‘
富士
’
等晚熟品种贮藏过 程中果实硬/脆度变化不大，而
‘
嘎拉
’
、
‘
金冠
’
和
‘
红星
’
等早/中熟苹果品种在采后贮藏过程中易 发生软化，严重影响果实口感及耐贮性，降低商品价值(齐秀东等，2015；张宗营，2016； Ge等，2019)。果实质地变化是其细胞壁结构与组分变化的表现，果胶作为细胞壁的主要组 分，其降解是导致果实软化的关键，而β
‑
半乳糖苷酶(β
‑
galactosidase，β
‑
gal)水解果胶侧链上 的半乳糖是造成果实软化的重要原因之一(Tateishi等，2008)。因此，研究苹果中β
‑
gal酶编 码基因的功能对提高苹果果实耐贮性具有重要意义。<br/>
技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于提供一种β
‑
半乳糖苷酶基因Mdβ
‑
gal18及在调控果实成熟软化中的应 用。
[0004]为了实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：
[0005]一种苹果β
‑
半乳糖苷酶基因Mdβ
‑
gal18，所述基因Mdβ
‑
gal18的DNA序列如SEQ ID NO：1 所示，共2196bp；所述基因Mdβ
‑
gal18编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，共编码 731个氨基酸。
[0006]包含上述苹果β
‑
半乳糖苷酶基因Mdβ
‑
gal18重组载体，也落入本专利技术的保护范围，本发 明所选用的重组载体为农杆菌过表达载体。
[0007]本专利技术还公开了上述基因超表达载体构建方法，具体为：
[0008]设计带有限制性酶切位点的特异引物扩增Mdβ
‑
gal18基因CDS序列，利用同源重组方法 将Mdβ
‑
gal18基因整合到超表达载体pRI
‑
101上，构建35S::Mdβ
‑
gal18重组质粒，并通过电 击法转化至GV3101农杆菌。引物序列如下：
[0009]Mdβ
‑
gal18
‑
FP：TCTTCACTGTTGATACATATGATGGGTGTTGGAATTCAAA；
[0010]Mdβ
‑
gal18
‑
RP：CGATCGGGGAAATTCGAGCTCCTAGAGCTTCTTCGCGTCG。
[0011]上述基因VIGS载体的构建方法，具体为：
[0012]设计带有限制性酶切位点的特异引物，扩增Mdβ
‑
gal18基因cDNA非保守区200
‑
400bp 片段，利用同源重组方法将所扩增片段插入到TRV2载体中，构建完成pTRV2
‑
Mdβ
‑
Gal18重 组质粒，并通过电击法转化至GV3101农杆菌。引物序列如下：
[0013]Mdβ
‑
Gal18
‑
TRV
‑
FP：ATTCTGTGAGTAAGGTTACCGAATTCGTCAAAACGTGAAC；
[0014]Mdβ
‑
Gal18
‑
TRV
‑
RP：TCTTCGGGACATGCCCGGGCCTCGAGGTACCATGTAAGGG。
[0015]本专利技术还通过瞬时过表达Mdβ
‑
gal18基因来验证了该基因的功能，经过研究发现，该基 因能够促进苹果果实成熟软化，具体表现为：能够加速苹果果实硬度的下降、增加乙烯释放 量、提高果实可溶性固形物含量以及促进果实色泽由绿变黄。
[0016]还可以通过抑制所述苹果β
‑
半乳糖苷酶基因Mdβ
‑
gal18或蛋白的功能表达能够抑制苹果 果实成熟软化，对于一些
‘
嘎拉
’
、
‘
金冠
’
和
‘
红星
’
等早/中熟苹果品种在采后贮藏过程中易发生 软化的果实储藏，可以采用这种方法。具体表现为将苹果β
‑
半乳糖苷酶基因Mdβ
‑
gal18沉默 能够延缓苹果果实硬度的下降、减少乙烯释放量、减少果实可溶性固形物含量以及抑制果实 色泽由绿变黄。
[0017]本专利技术的优点：
[0018]本专利技术公开了一种苹果β
‑
半乳糖苷酶基因Mdβ
‑
gal18，专利技术人分析了该基因在不同处理苹 果果实采后贮藏过程中的表达模式，利用瞬时过表达和VIGS技术验证Mdβ
‑
gal18基因在苹 果果实后熟软化中的作用，发现过表达Mdβ
‑
gal18基因的苹果果实与对照果实相比，乙烯释 放显著升高，硬度显著降低，果实颜色明显变黄；而沉默Mdβ
‑
gal18基因的苹果果实乙烯释 放显著降低，果实颜色偏青。说明该基因可以调控苹果果实后熟软化，对培育耐贮运的苹果 新品种具有积极的指导作用。
[0019]有利于从分子机制上阐明苹果β
‑
半乳糖苷酶基因Mdβ
‑
gal18在调控苹果果实后熟软化中 的作用，为苹果分子育种提供理论基础和基因资源。
[0020]对于一些
‘
嘎拉
’
、
‘
金冠
’
和
‘
红星
’
等早/中熟苹果品种在采后贮藏过程中易发生软化的果实 储藏，可以通过敲除β
‑
半乳糖苷酶基因Mdβ
‑
gal18或者同源基因的方式培育一些新品种。
附图说明
[0021]图1是乙烯和1
‑
MCP处理对金冠果实采后软化的影响；
[0022]图2是Mdβ
‑
gal18基因全长PCR扩增电泳图；
[0023]图3是Mdβ
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.苹果β
‑
半乳糖苷酶基因Mdβ
‑
gal18，其特征在于，所述基因Mdβ
‑
gal18的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。2.权利要求1所述的苹果β
‑
半乳糖苷酶基因Mdβ
‑
gal18编码的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。3.包含权利要求1所述苹果β
‑
半乳糖苷酶基因Mdβ
‑
gal18重组载体。4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为农杆菌过表达载体。5.权利要求1所述的苹果β
‑
半乳糖苷酶基因Mdβ<...

【专利技术属性】
技术研发人员：王苗苗，郑先波，冯建灿，吴尧，王豪，陈明，黄松，白团辉，焦健，宋春晖，宋尚伟，庞宏光，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：