基于Cas13a无扩增检测H7亚型禽流感病毒方法技术

本发明专利技术公开了一种基于CRISPR

【技术实现步骤摘要】
基于Cas13a无扩增检测H7亚型禽流感病毒方法
[0001]本专利技术涉及一套用于病毒快速检测的实时检测方法，尤其涉及一套基于CRISPR
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Cas13a无扩增直接检测H7亚型禽流感病毒的方法，属于H7亚型禽流感病毒检测领域。

技术介绍

[0002]禽流感（Avian influenza）是一种由甲型流感病毒引起的禽类急性、热性、败血性的传染病，属法定的一类传染病。根据禽流感病毒（AIV）对禽类致病性的不同，AIV可以分为低致病性禽流感病毒（LPAIV）和高致病性禽流感病毒（HPAIV）。高致病性禽流感对禽类具有高度致死性，是严重危害养禽业的烈性传染病。该病极易在禽鸟间散播，可引致家禽大量死亡，对家禽业带来不可估量的破坏，发生之时会造成巨大的经济损失。由于病毒基因变异后能够感染人类，所以禽流感是一种人兽共患的烈性传染病。人感染后的症状主要表现为高热、咳嗽、流涕、肌痛等，多数伴有严重的肺炎，严重者心、肾等多种脏器衰竭导致死亡，病死率很高。此病可通过消化道、呼吸道、皮肤损伤和眼结膜等多种途径传播。
[0003]近年来，引起家禽爆发禽流感的高致病性和低致病性H7亚型禽流感病毒株包括H7N1、H7N2、H7N3、H7N4 和H7N7 亚型，导致7500万只家禽被扑杀。受到禽类H7亚型病毒影响的国家包括中国、巴基斯坦、澳大利亚、爱尔兰、意大利、加拿大、德国、智利、荷兰、墨西哥、英国和美国等，其中中国、加拿大、美国、荷兰、意大利、墨西哥和英国都有人的感染病例，从某种程度上说这些亚型的病毒给全球公共卫生带来巨大风险。特别是自2013年3月以来我国爆发的人感染H7N9禽流感，截至2019 年6 月24 日，已造成1568人感染，其中615人死亡。由于H7亚型具有高致病性，又由于感染人的H7亚型病毒存在极大的多样性，因此对禽类H7亚型禽流感病毒的检测，以及对H7亚型禽流感病毒暴露人群，包括农场工人、参与家禽捕杀者及其家属以及处理H7病毒疫情的相关医务人员进行主动监测是十分必要的。
[0004]目前，禽流感病毒的临床诊断方法主要包括病毒分离方法（Viral isolation）、血清学检测方法（H7N9 Serologic testing）和分子生物学方法三大类。其中，临床应用的分子生物学方法主要指实时荧光定量PCR（Real
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time reverse
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transcriptase
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polymerase
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chain
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reaction (RT
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PCR) assay）核酸分子诊断方法，也是诊断杭州型H7N9甲型禽流感病毒最常用的方法。然而传统的PCR反应对温度具有一定的依赖性，需要精准的温度循环变化设备作为技术保障，不仅增加了检测时间，也增加了检测的成本。
[0005]成簇规律间隔短回文重复序列及其相关基因（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated gene，CRISPR/Cas）系统是存在于细菌和古菌中的一种适应性免疫系统，能在单链向导RNA（Single guide RNA，sgRNA）指引下将Cas核酸酶与靶序列相结合并对其进行切割。该系统中的CRISPR/Cas13是目前CRISPR/Cas家族中唯一只靶向单链RNA（Single
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stranded RNA，ssRNA）的系统，自2016年6月报道以来，CRISPR/Cas13系统就备受全球研究人员的关注和重视，这不仅因为它是一种只靶向RNA的新型CRISPR系统，更重要的是其具有特异性切割和“附带切割”（collateral cleavage）能力。高的靶向效率和优异的酶切能力使CRISPR/Cas13系统在核酸检测方面具有广阔的应用前景。
[0006]2017年，Liu等与Knott等分别解析了Cas13a单蛋白、Cas13a
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crRNA二元复合物、Cas13a
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crRNA及靶RNA三元复合物晶体结构，并指出Cas13a是一种RNA介导的具有RNase活性的Cas效应蛋白，通过其2个HEPN结构域内的保守氨基酸可以有效地降解ssRNA。同年，张峰研究团队设计研发出基于CRISPR/Cas13系统的特异性高灵敏度酶报告解锁（Specific high
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sensitivity enzymatic reporter unlocking，SHERLOCK）技术。该技术首先对靶DNA或RNA进行重组酶聚合酶扩增（Recombinase polymerase amplification，RPA）扩增，扩增后的DNA产物用T7核糖核酸聚合酶转录为RNA，然后在crRNA（CRISPR RNA）引导下激活Cas13a，激活的Cas13a切割RNA荧光报告分子从而能检测到荧光信号。
[0007]本研究专利技术了一种利用CRISPR
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Cas13a检测系统，无需病毒基因组的预扩增、直接快速检测H7亚型禽流感病毒RNA的方法。与以往的CRISPR检测方法不同，本专利技术通过直接检测病毒RNA而不需要额外扩增的操作，可对H7 亚型禽流感病毒进行快速、准确和低成本的筛查。

技术实现思路

[0008]本专利技术的主要目的是提供一套基于CRISPR
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Cas13a系统无扩增直接检测H7亚型禽流感病毒的快速检测方法。
[0009]本专利技术采用的检测原理如图1所示，当靶RNA（H7亚型禽流感病毒RNA）出现时，靶RNA在crRNA引导下激活Cas13a，激活的Cas13a除了进行靶RNA特异性切割外，还“附带切割”RNA荧光报告分子，随着连接荧光基团和淬灭基团之间的RNA链断裂RNA荧光报告分子发出荧光，而通过检测荧光信号即可进行靶RNA（H7亚型禽流感病毒RNA）的核酸检测。
[0010]为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案具体如下：基于CRISPR
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Cas13a无扩增直接检测H7亚型禽流感病毒方法，包括以下步骤：（1）提取样品RNA；（2）配制CRISPR
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Cas13a检测分析体系；（3）在检测分析体系中加入待测样品RNA；（4）在37度等温条件下反应30
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60分钟，实时检测CRISPR
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Cas13a附带切割释放的荧光信号。
[0011]其中，检测分析体系包括反应缓冲液、适量CRISPR
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Cas13a（LwaCas13a）基因编辑蛋白、H7
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AIV特异性srRNA及荧光报告分子。反应缓冲液的组分包括：10mM Tris
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HCl (pH 8.3), 50mM KCl, 1.5mM MgCl2。H7特异性crRNA核酸序列为：GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACCAUCA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于CRISPR
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Cas13a无扩增直接检测H7亚型禽流感病毒方法，其特征在于，包括以下步骤：提取样品RNA；配制CRISPR
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Cas13a检测分析体系；在检测分析体系中加入待测样品RNA；在37度等温条件下反应30
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60分钟，实时检测CRISPR
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Cas13a附带切割释放的荧光信号。2.根据权利要求1所述的基于CRISPR
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Cas13a无扩增直接检测H7亚型禽流感病毒方法，其特征在于： CRISPR
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Cas13a检测分析体系包括反应缓冲液、CRISPR
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Cas13a（LwaCas13a）基因编辑蛋白、荧光报告分子及H7
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AIV特异性srRNA；经优化后20
µ
L反应体系中包括2
µ

【专利技术属性】
技术研发人员：殷宏，邹明强，王玉峰，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：