基于F12基因甲基化的肝癌早期检测制造技术

一种用于肝癌早筛的核酸甲基化检测方法以及相应的用于肝癌检测的试剂盒。其检测的甲基化基因包含F12(Coagulation factor XII)基因，检测的样本包括组织样本和血浆样本。检测的样本包括组织样本和血浆样本。

【技术实现步骤摘要】
基于F12基因甲基化的肝癌早期检测


[0001]本专利技术涉及一种基于F12基因甲基化的肝癌检测方法，以及相应的用于肝癌检测的试剂盒，可用于肝癌的筛查。

技术介绍

[0002]原发性肝细胞癌(HCC)是我国发病率第5、死亡率第2的恶性肿瘤。近5年中国大陆地区原发性肝癌平均年发病例数为42.3万例，占全球42.5％。原发性肝癌的病理类型包括肝细胞癌(HCC)、胆管细胞癌(ICC)和HCC
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ICC混合型肝癌，其中HCC占85
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90％。肝癌严重威胁我国人民的生命健康，我国肝癌的五年总生存率目前只有14.1％。一个重要原因在于我国肝癌的早期确诊率低，超过70％的患者在确诊时已经为中晚期，错过最佳的治疗时期。而对于单个肿瘤直径小于3
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5cm的小肝癌，利用手术和放化疗联合治疗后，患者的5年生存率可超过60％。所以肝癌的早筛早诊对于提高患者生存率和治疗效果非常重要。
[0003]肝癌有明确的病因及危险因素。在我国，乙型肝炎病毒(HBV)感染、丙型肝炎病毒(HCV)感染、酒精性肝病(ALD)、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、黄曲霉素暴露和糖尿病等都是肝癌的病因，另外肝癌家族史、吸烟和药物性肝脏损伤也是肝癌的危险因素。而各种原因导致的肝硬化是原发性肝癌发生的主要危险因素，例如HBV相关肝硬化患者的肝癌年发生率达3％～6％。根据我国原发性肝癌诊疗指南，对于男性35岁以上、女性45岁以上的肝癌高危人群，应定期进行筛查。
[0004]目前在临床领域，肝癌的筛查手段主要是超声影像检查和血清甲胎蛋白(AFP)，指南建议肝癌高危人群应每6个月进行一次腹部超声和血清AFP检测。但AFP检测对早期肝癌的灵敏度低(低于50％)，而超声影像检测十分受限于技师的经验和仪器性能等因素，其对于早期肝癌的灵敏度同样较低。近年来，随着液体活检技术的发展，一些新型肝癌标志物如游离DNA(cfDNA)、微小RNA(miRNA)陆续被开发，并被证明在肝癌诊断中具有一定的应用价值。
[0005]血浆cfDNA包含一系列来源于身体不同组织的片段化细胞DNA，这些DNA往往通过细胞外分泌、细胞凋亡或细胞坏死进入血液。以往的研究表明，不同的组织具有不同的DNA甲基化特征，因此可以通过一些组织特异性甲基化标记位点或区域进行cfDNA组织溯源。Sun等利用二代测序进行不同组织来源DNA的定量分析，并将该技术应用于不同临床场景的应用，如孕妇的产前诊断、癌症诊断和器官移植后监测等(Sun,K.,P.Jiang,K.C.A.Chan等,2015.Plasma DNAtissue mapping by genome
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wide methylation sequencing for noninvasive prenatal,cancer,and transplantation assessments.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.112:E5503
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E5512)。但利用二代测序进行cfDNA组织溯源的步骤繁琐、成本高昂，不利于技术转化，而荧光定量PCR方法可以解决上述问题。Lehmann
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Werman等利用荧光定量PCR检测若干组织特异性甲基化标记进行不同组织来源cfDNA的定量评估，并将该技术应用于临床的疾病预警(Lehmann
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Werman,R.,D.Neiman,H.Zemmour等,2016.Identification of tissue
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specific cell death using methylation patterns of circulating DNA.
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.113:E1826
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E1834.)。Liu等利用实验室自建的MCTA
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Seq二代测序技术及对应的生信分析方法，对健康人、肝炎、肝癌等人群的血浆样本进行了不同组织来源cfDNA定量分析，发现肝癌患者的肝组织来源cfDNA含量显著高于健康人、肝炎患者和肝硬化患者的水平(Liu X.,Ren J.,Luo N.等,(2019).Comprehensive DNAmethylation analysis of tissue of origin of plasma cell
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free DNAby Methylated CpG Tandem amplification and sequencing(MCTA
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Seq).Clin.Epigenet.11:93.)。

技术实现思路

[0006]具体地，本专利技术通过如下各项技术方案解决现有技术中存在的技术问题。
[0007]1.一种用于肝癌检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含核酸甲基化检测试剂，所述核酸甲基化检测试剂检测的甲基化基因包含F12(Coagulation factor XII)基因。
[0008]2.根据项1所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸甲基化检测试剂为血浆游离核酸甲基化检测试剂，且所述F12基因是由F12基因产生的血浆游离核酸。
[0009]3.根据项1或2所述的试剂盒，其特征在于，在对甲基化基因进行检测之前，将核酸进行亚硫酸盐转化。
[0010]4.根据项1
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3任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述F12基因甲基化检测试剂所检测的甲基化序列区段包含与SEQ ID NO:4序列有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，至少99.5％，或100％相同性的序列。
[0011]5.根据项1
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4任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述F12基因甲基化检测试剂包含至少一个正向引物，至少一个反向引物，和/或至少一个探针。
[0012]6.根据项5所述的试剂盒，其特征在于，所述至少一个探针包含选自含SEQ ID NO:3,13
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15任一个的探针。
[0013]7.根据项5或6所述的试剂盒，其特征在于，所述至少一个正向引物和/或至少一个反向引物包含选自含SEQ ID NO:1
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2,7
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12任一个的引物。
[0014]8.根据项1
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7任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述F12基因甲基化检测试剂包含选自含SEQ ID NO:7
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9任一个的正向引物，选自含SEQ ID NO:10
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12任一个的反向引物，和/或选自含SEQ ID NO:13
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15任一个的探针。
[0015]9.根据项1
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8任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述F12基因甲基化检测试剂包含引物探针组合1：含SEQ ID NO:7的正向引物，含SEQ ID NO:10的反向引物，和含SEQ ID 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于肝癌检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含核酸甲基化检测试剂，所述核酸甲基化检测试剂检测的甲基化基因包含F12(Coagulation factor XII)基因。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸甲基化检测试剂为血浆游离核酸甲基化检测试剂，且所述F12基因是由F12基因产生的血浆游离核酸。3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，在对甲基化基因进行检测之前，将核酸进行亚硫酸盐转化。4.根据权利要求1
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3任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述F12基因甲基化检测试剂所检测的甲基化序列区段包含与SEQ ID NO:4序列有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，至少99.5％，或100％相同性的序列。5.根据权利要求1
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4任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述F12基因甲基化检测试剂包含至少一个正向引物，至少一个反向引物，和/或至少一个探针。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述至少一个探针包含选自含SEQ ID NO:3,13
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15任一个的探针。7.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于，所述至少一个正向引物和/或至少一个反向引物包含选自含SEQ ID NO:1
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2,7
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12任一个的引物。8.根据权利要求1
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7任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述F12基因甲基化检测试剂包含选自含SEQ ID NO:7
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9任一个的正向引物，选自含SEQ ID NO:10
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12任一个的反向引物，和/或选自含SEQ ID NO:13
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15任一个的探针。9.根据权利要求1
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8任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述F12基因甲基化检测试剂包含引物探针组合1：含SEQ ID NO:7的正向引物，含SEQ ID NO:10的反向引物，和含SEQ ID NO:13的探针。10.根据权利要求1
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8任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述F12基因甲基化检测试剂包含引物探针组合2：含SEQ ID NO:8的正向引物，含SEQ ID NO:11的反向引物，和含SEQ ID NO:14的探针。11.根据权利要求1
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8任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述F12基因甲基化检测试剂包含引物探针组合3：含SEQ ID NO:9的正向引物，含SEQ ID NO:12的反向引物，和含SEQ ID NO:15的探针。12.根据权利要求1
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7任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述F12基因甲基化检测试剂包含引物探针组合4：含SEQ ID NO:1的正向引物，含SEQ ID NO:2的反向引物，和含SEQ ID NO:3的探针。13.根据权利要求2
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12任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述血浆游离核酸为血浆游离DNA。14.根据权利要求1
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13任一项所述的试剂盒，其特征在于，用B2M基因作为内参基因。15.根据权利要求1
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14任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述肝癌为早期肝癌。16.根据权利要求2
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15任一项所述的试剂盒，其特征在于，还包含游离核酸提取试剂，所述游离核酸提取试剂通过磁珠法提取并纯化血浆游离核酸。17.一种检测肝癌的方法，其特征在于，所述方法包含对样本中F12基因甲基化的检测。18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述样本中的F12基因是由F12基因产生的血浆游离核酸。
19.根据权利要求17或18所述的方法，其特征在于，所述方法包含在甲基化检测之前对核酸进行亚硫酸盐转化。20.根据权利要求17
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【专利技术属性】
技术研发人员：李德强，张茜，陈卓君，黄龙妹，吕宁，陈一友，
申请(专利权)人：杭州诺辉健康科技有限公司，
类型：发明
国别省市：