一种在赤霉菌中建立的基于CRISPR技术整合的URA-Blaster方法技术

本发明专利技术涉及基因工程技术，公开了一种在赤霉菌中建立的基于CRISPR技术整合的URA

【技术实现步骤摘要】
一种在赤霉菌中建立的基于CRISPR技术整合的URA
‑
Blaster方法


[0001]本专利技术涉及基因工程技术，具体地，涉及一种在赤霉菌中建立的基于CRISPR技术整合的URA
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Blaster方法。

技术介绍

[0002]赤霉菌以能够生产一系列的植物激素——赤霉素(Gibberellins，简称GAs)而闻名。赤霉素是一种天然的、能够影响植物生长的激素，具有解除种子和块茎的睡眠、促进植物生长发育、加快果实成熟等功能，它的调节能力很强，因而在农业上得到了广泛的运用。
[0003]随着对赤霉素研究的不断加深，已经有超过136种不同结构的赤霉素类化合物(编号GA1
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GA136)被发现，其中只有GA1、GA3、GA4、GA7等具有生物活性。目前工业化生产的赤霉素主要为GA3，然而GA3存在生理活性过强、作用效果单一等局限性，相比之下，GA4+GA7组合更高效、更稳定、更安全，它能显著地促进植物茎、叶生长，特别是对遗传型和生理型的矮生植物有明显的促进作用，因此GA4+GA7组合逐渐成为本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种在赤霉菌中建立的基于CRISPR技术整合的URA
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Blaster方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)以URA3基因缺失的赤霉菌作为出发菌，利用Crispr技术将筛选标记HisG
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URA3
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HisG片段整合到所述出发菌的基因组上，得到阳性转化菌；(2)将所述阳性转化菌的基因组上URA3基因丟除，以能够再次作为出发菌循环利用URA3筛选标记进行遗传转化；其中，所述HisG
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URA3
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HisG片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所示URA3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述URA3基因缺失的赤霉菌的制备方法包括以下步骤：构建URA3敲除质粒，将所述URA3敲除质粒转化至感受态的赤霉菌中得到转化子I，然后在所述转化子I中挑选出URA3基因成功敲除的菌株。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述URA3敲除质粒为FfCas9
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URA3
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HR质粒；优选地，所述FfCas9
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URA3
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HR质粒的制备过程包括：以FfCas9
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URA3质粒为骨架质粒，将所述FfCas9
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URA3质粒先用StuI酶切后插入URA的上游同源臂URA3
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UP得到FfCas9
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URA3
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UP，再用SwaI酶切后插入URA的下游同源臂URA3
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DN得到FfCas9
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URA3
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HR；其中，所述URA3
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UP的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述URA3
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DN的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述FfCas9
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URA3质粒的制备过程包括：将pUC
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fFuCas9
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HTBNLS
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hph质粒用内切酶EcoRI酶切后形成pUC
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fFuCas9
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HTBNLS
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hph线性片段，以FfCas9
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URA3
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PPT1质粒为模板，设计引物5sURA3
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F和5sURA3
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R，进行PCR扩增，得到5sURA3
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N20
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gRNA线性片段，将所述5sURA3
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N20
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gRNA线性片段与所述pUC
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fFuCas9
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HTBNLS
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hph线性片段进行克隆；其中，所述5sURA3
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F的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述5sURA3
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R的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述5sURA3
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N20
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gRNA线性片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述挑选出URA3基因成功敲除的菌株的过程包括：将所述转化子I培养后提取得到转化子I基因组，以所述转化子I基因组为模板设计两对引物URA3
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YZ
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F和cas9
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YZ
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R，URA3
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YZ
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R和cas9
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YZ
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F，然后进行PCR扩增，所述两对引物均能够扩增出大小正确的条带即为URA3基因成功敲除的菌株；其中，所述URA3
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YZ
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F的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示，所述URA3
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YZ
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R的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示，所述cas9
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YZ
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R的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示，所述cas9
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YZ
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F的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示。6.根据权利要求1至5中任意一项所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述Crispr技术将筛选标记HisG
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URA3
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HisG片段整合到所述出发菌的基因组上的过程包括：将含有所述HisG
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URA3
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HisG片段的pUC
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FfHUH
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5sFCC1
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HR质粒转化至感受态的所述出发菌中，同时敲除FCC1基因片段。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述pUC
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FfHUH
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5sFCC1
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HR质粒的制备方法包括：S1、将pUC
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HUH质粒使用KpnI以及BamHI进行双酶切，以切除URA3片段，得到酶切后的
pUC
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HUH质粒；以赤霉菌基因组为模板，设计引物TRPC
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F和TRPC
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R扩增出启动子TRPC，设计引物FFura3
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【专利技术属性】
技术研发人员：黄和，施天穹，杨彩玲，沈琦，彭倩倩，
申请(专利权)人：南京师范大学，
类型：发明
国别省市：