一种提高芽孢率的嗜热脂肪芽孢杆菌培养液及培养方法技术

本发明专利技术涉及菌株培养技术领域，尤其涉及一种提高芽孢率的嗜热脂肪芽孢杆菌培养液及培养方法。本发明专利技术提供的嗜热脂肪芽孢杆菌的培养液中成分合理，更适合芽孢形成。配合该方法，能够在24h内获得大量芽孢。该培养物用于压力蒸汽灭菌生物指示剂具有良好的指示作用。汽灭菌生物指示剂具有良好的指示作用。

【技术实现步骤摘要】
一种提高芽孢率的嗜热脂肪芽孢杆菌培养液及培养方法


[0001]本专利技术涉及菌株培养
，尤其涉及一种提高芽孢率的嗜热脂肪芽孢杆菌培养液及培养方法。

技术介绍

[0002]在灭菌程序验证中，尽管可通过灭菌过程某些参数的监控来评估灭菌效果，但生物指示剂的被灭杀程度，则是评价一个灭菌程序有效性最直观的的指标。可使用市售的标准生物指示剂，也可使用有日常生产污染菌监控中分离的耐受性最强的微生物制备的孢子。在生物指示剂验证试验中，需确定孢子在实际灭菌条件下的D值，并测定孢子的纯度和数量。验证时，生物指示剂的微生物用量应比日常检出的微生物污染量大，耐受性强，以保证灭菌程序有更大的安全性。在最终灭菌法中，生物指示剂应放在灭菌柜的不同部位。并避免指示剂直接接触到被灭菌物品。生物指示剂按设定的条件灭菌后取出，分别置培养基中培养，确定生物指示剂中的孢子是否被完全杀灭。过度杀灭产品灭菌验证一般不考虑微生物污染水平，可采用市售的生物指示剂。对灭菌手段耐受性差的产品，设计灭菌程序时，根据经验预计在该生产工艺中产品微生物污染的水平，选择生物指示剂的菌种和孢子数量。这类产品的无菌保证应通过监控每批灭菌前的微生物污染的数量、耐受性和灭菌程序验证所获得的数据进行评估。在医疗机构的灭菌生物监测中，WS310国家标准已明确规定：1、压力蒸汽灭菌过程为每周一次，使用压力蒸汽灭菌生物指示剂；2、环氧乙烷气体灭菌为每批次都要监测，使用环氧乙烷灭菌生物指示剂；3、低温等离子体灭菌为每日监测一次，使用低温等离子体灭菌生物指示剂。以上三种灭菌方式，也是目前医疗机构的主要灭菌方式，其中，压力蒸汽灭菌和过氧化氢等离子灭菌使用最为广泛。
[0003]嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)属嗜热性需氧芽孢杆菌，但兼有厌氧的特性，细菌繁殖体G兰氏染色阳性呈紫色，细菌芽孢孔雀绿着色。嗜热脂肪芽孢杆菌比较容易识别且对人体没有危害性，一般作为空间消毒的指示生物。嗜热脂肪地芽孢杆菌的芽孢被广泛应用于压力蒸汽灭菌和过氧化氢等离子体灭菌的生物监测领域。目前，使用液体发酵法生产嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢的具有数量大，发酵周期短等优点。但其主要问题为芽孢形成率低，极大限制了该工艺在生产嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢中的应用。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供一种提高芽孢率的嗜热脂肪芽孢杆菌培养液及培养方法，该方法能够解决液体发酵批量生产嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢中芽孢率形成率低的问题。
[0005]本专利技术提供的提高芽孢率的嗜热脂肪芽孢杆菌培养液组合，其特征在于，包括：活种子培养基和发酵培养基；
[0006]所述种子培养基包括水和0.5wt％～0.7wt％牛肉浸粉，1.0wt％～1.5wt％蛋白胨，0.3wt％～0.4wt％氯化钠，pH值为7.0～7.2；
[0007]所述发酵培养基包括水和葡萄糖0.3wt％～0.4wt％，蛋白胨1.0wt％～1.5wt％，胰蛋白胨0.2wt％～0.25wt％，磷酸氢二钾0.1wt％～1.5wt％，磷酸二氢钾0.10wt％～0.15wt％，氯化镁0.02wt％～0.04wt％，酵母提取物0.3wt％～0.5wt％，氯化钠0.3wt％～0.4wt％，氯化亚铁0.0015wt％～0.002wt％，氯化钙0.02wt％～0.04wt％和0.01％～0.03％消泡剂，pH值为7.6。
[0008]一些实施例中，所述种子培养基包括水和0.5wt％牛肉浸粉，1.0wt％蛋白胨，0.3wt％氯化钠，pH值为7.0～7.2。
[0009]一些实施例中，所述发酵培养基包括水和葡萄糖0.3wt％～0.4wt％，蛋白胨1.0wt％～1.5wt％，胰蛋白胨0.2wt％～0.25wt％，磷酸氢二钾0.1wt％～1.5wt％，磷酸二氢钾0.10wt％～0.15wt％，氯化镁0.02wt％～0.04wt％，酵母提取物0.3wt％～0.5wt％，氯化钠0.3wt％～0.4wt％，氯化亚铁0.0015wt％～0.002wt％，氯化钙0.02wt％～0.04wt％和0.01％～0.03％消泡剂，pH值为7.6。
[0010]本专利技术实施例中，所述消泡剂为有机硅烷类消泡剂。一些具体实施例中，所述消泡剂具体为DF8018(来自德丰消泡剂公司)。
[0011]本专利技术提供的培养基，更有利于嗜热脂肪芽孢杆菌形成芽孢。相对于现有技术而言，以本专利技术提供的培养基培养嗜热脂肪芽孢杆菌能够获得更高的芽孢率。
[0012]本专利技术还提供了一种嗜热脂肪芽孢杆菌的培养方法，其将嗜热脂肪芽孢杆菌以所述培养液组合活化、发酵，制得嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢发酵液。
[0013]所述活化的条件包括：58～60℃，180～200转/min震荡16～18h。
[0014]所述发酵的温度为58～60℃，所述发酵的条件包括：接种后0～4h，0.5～1vvm通气不搅拌；4h～24h，溶氧为30％，搅拌转速为50～800转/min；第12～16h时，加入Mn
2+
至其质量分数为0.01％～0.03％。
[0015]一些实施例中，所述锰离子来自硫酸亚锰或氯化亚锰。
[0016]一些实施例中，所述加入Mn
2+
的时间是第12h。
[0017]本专利技术还提供了一种灭菌生物指示剂，其由生物指示物、恢复培养基和检测管组成，
[0018]所述生物指示物由本专利技术所述制备方法制得的嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢发酵液和滤纸制得。
[0019]一些实施例中，所述恢复培养基包括水和9～12g/L葡萄糖，1～3g/L蔗糖，8～12g/L蛋白胨1～3g/L可溶性淀粉，2～4g/L氯化钠，0.3～0.5g/L的L
‑
丙氨酸和1.6ml的1％溴甲酚紫。
[0020]本专利技术首先通过使用分段控制溶氧，前期30％溶氧，pH7.0保证菌体大量增殖，后期10％溶氧，pH7.6易于芽孢的形成，结合在12h～16h后锰离子加入到发酵液中诱导的方法，控制pH7.2
‑
7.6之间，最高为7.6。在24小时内，实现了高密度、高芽孢率嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢的液体发酵生产，芽孢率达到了95％以上，且芽孢生成周期较短。
[0021]本专利技术中，所述生物指示物的制备方法包括将本专利技术所述制备方法制得的嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢发酵液经3500转/min，20min离心5次，沉淀以PBS缓冲液重悬后，3500转/min搅拌4h获得嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢的菌悬液；将所述菌悬液滴染于滤纸，制备获得生物指示物。
[0022]本专利技术提供了提高芽孢率的嗜热脂肪芽孢杆菌的培养液组合，及其培养方法。本专利技术提供的嗜热脂肪芽孢杆菌的培养液中成分合理，更适合芽孢形成。配合该方法，能够在24h内获得大量芽孢。该培养物用于灭菌生物指示剂具有良好的指示作用。
具体实施方式
[0023]本专利技术提供了一种提高芽孢率的嗜热脂肪芽孢杆菌培养液及培养方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高芽孢率的嗜热脂肪芽孢杆菌培养液组合，其特征在于，包括：活种子培养基和发酵培养基；所述种子培养基包括水和0.5wt％～0.7wt％牛肉浸粉，1.0wt％～1.5wt％蛋白胨，0.3wt％～0.4wt％氯化钠，pH值为7.0～7.2；所述发酵培养基包括水和葡萄糖0.3wt％～0.4wt％，蛋白胨1.0wt％～1.5wt％，胰蛋白胨0.2wt％～0.25wt％，磷酸氢二钾0.1wt％～1.5wt％，磷酸二氢钾0.10wt％～0.15wt％，氯化镁0.02wt％～0.04wt％，酵母提取物0.3wt％～0.5wt％，氯化钠0.3wt％～0.4wt％，氯化亚铁0.0015wt％～0.002wt％，氯化钙0.02wt％～0.04wt％和0.01wt％～0.03wt％消泡剂，pH值为7.6。2.根据权利要求1所述的培养液组合，其特征在于，所述种子培养基包括水和0.5wt％牛肉浸粉，1.0wt％蛋白胨，0.3wt％氯化钠，pH值为7.0～7.2；所述发酵培养基包括水和葡萄糖0.3wt％，蛋白胨1.0wt％，胰蛋白胨0.25wt％，磷酸氢二钾0.1wt％，磷酸二氢钾0.10wt％，氯化镁0.02wt％，酵母提取物0.4wt％，氯化钠0.3wt％，氯化亚铁0.0015wt％，氯化钙0.02wt％和0.01wt％消泡剂，pH值为7.6。3.根据权利要求1或2所述的培养液组合，其特征在于，所述消泡剂为无机硅烷类消泡剂。4.一种嗜热脂肪芽孢杆菌的培养方法，其特征在于，将嗜热脂肪芽孢杆菌以权利要求1～3任一项所述培养液组合活...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵帅帅，卢方斌，田友昊，
申请(专利权)人：山东新华医疗器械股份有限公司，
类型：发明
国别省市：